SNT 1450-2004 咖啡美洲叶斑病菌鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 4 5 0-2 0 0 4咖 啡 美洲 叶斑 病 菌 鉴定 方 法Me t h o d s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f My c e n a c i t r i c o l o r(B e r k.&C u r t.)S a c c2 0 0 4-0 6-0 1 发布2 0 0 4-1 2-0 1 实施中华人民共和国国家 质 量 监 督检 验 检疫 总 局发 布S N/T 1 4 5 0-2 0 0 4前言本标准的附录A和附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广州出人境检验检疫局。本标准主要起草人:钟国强、张传飞、司徒保禄、赵立荣。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。S N/T 1 4 5 0-2 0 0 4咖 啡 美 洲 叶 斑 病 菌 鉴 定 方 法范 围 本标准规定了咖啡美洲叶斑病菌的鉴定方法。本标准适用于来源于咖啡美洲叶斑病疫区(参见附录 A)的咖啡和其他主要寄主植物苗木(参见附录 B)携带的咖啡美洲叶斑 病菌的鉴定。术语和定义 下列术语和定义适用于本标准口2.1 芽抱 g e m m a e 咖啡美洲叶斑病菌的无性繁殖体，一种黄色的针状结构，由茎和飞碟状芽抱体组成，是该病的主要传播繁殖结构。2.2 担子果b a s id i o c a r p 咖啡美洲叶斑病菌的有性生殖体，一种黄色的伞状小菇。3原理3.1 咖啡美洲叶斑病菌的分类地位 咖 啡美洲叶斑病菌 M y c e n a c i t r i c o l o r(B e r k.乙C u r t.)S a c c ，属担子菌亚门(B a s id i o m y c o t i n a),层菌纲(H y m e n o m y c e t e s)、伞菌目(A g a r ic a l e s)、伞菌科(A g a r ic a c e a e)、小菇属(My c e n a),咖啡美洲叶斑病现局限发生在美洲的一些国家和地区，主要为害咖啡属植物的叶片、嫩枝和嫩果，气候条件与环境条件 适合时，也可为害其他科属植物。病害 英文名:A m e r i c a n L e a f S p o t o f C o f f e e.3.2检疫原理 咖啡美洲叶斑病菌为美洲热带潮湿山区和森林地区的一种弱寄生菌，通常腐生于腐朽的树干或腐殖质中，在适宜的气候和环境下，病原菌的菌丝体可以寄生咖啡和其他寄主植物组织，使寄主发病，产生坏死病斑。病原菌产生两种繁殖结构:无性生殖的芽抱和有性生殖的担子果(担子果的产生通常需要用青霉菌诱发)。通过检疫来自该病发生地区的寄主苗木，分离纯化病原菌，利用该病的症状特征和病原特征进行鉴定。3.3鉴定原理 咖啡美洲叶斑病的症状、病原菌形态特征和生物学特性(培养性状和生物荧光的产生)是该病鉴定的主要依据。44.14.24.34.44.54.6仪器和试剂生物显微镜体视显微镜高压灭菌器。超净工作台。生物培养箱。塑料盒(2 8 c mX2 2 c m)S N/T 1 4 5 0-2 0 0 44.7 5%次氯酸钠(N a C I O)溶液。4.8 马铃薯葡萄糖琼脂(P D A)培养基。5 检验方法5.1 组织保湿法 用塑料盒作为培养器皿，在盒内铺上保湿滤纸，将采集的病叶组织样品置于滤纸上，喷雾保持病叶高度湿润，置 2 5 培养箱内在自然光或弱光下培养，3d 后取出叶片观察病斑上有无针状、黄色的芽抱产生，如发现芽抱，将芽抱移至 P D A培养基内继续培养，观察菌落形态、颜色、芽抱以及担子果的产生情况。5.2 培养基法 剪取可疑的病斑组织，用 5%次氯酸钠溶液消毒5 mi n，灭菌水洗三至四次，将病斑组织移到 P D A的培养基中，置 2 5 0C 培养，3d 后观察菌落的形态、颜色、芽抱以及担子果的产生情况。5.3 生物荧光观察方法 将病叶或培养菌落，带进黑暗的房间中，停留 1 5 m i n以适应黑暗的环境，肉眼观察病叶上病斑或培养的菌落是否可以产生生物荧光。5.4 担子果诱发试验 取分离纯化的咖啡美洲叶斑病菌可疑待测菌和青霉菌 P e n i c i l l i u m s p p.的菌落，分别接种于同皿P D A培养基的一侧培养，培养 3 d后该菌与青霉菌菌落交界处拮抗带的边沿可产生大量芽抱及黄色、伞状 的担子果。55 致病性试验 按5.1 组织保湿法在盒内平铺三层保湿滤纸，取分离纯化得到的芽抱或菌丝(注:不能用担子果)接种在冲洗干净的健康咖啡或其他寄主叶片上，每 天喷雾保湿，观察症状 和病原 的产生情况。鉴定特征1症状特 征1.1 病叶上病斑大小为3 mm-1 0 mm，多数为 4 mm-6 m m，典型的病斑为圆形，黄褐色至浅红褐，病部正面稍凹陷，病斑中央往往残留着芽抱人侵叶片时留下稻杆颜色的芽抱体。病健交界明显，形6氏已色状如鸡眼(又叫鸡眼病)。当两个以上病斑连接时，病斑形状不规则形。干旱季节，病部的坏死组织会脱落，流下空洞。叶脉上的病斑向两边稍伸长，凹陷，浅灰色，病部有散生的乳黄色晕圈，晕圈外有狭窄的暗色边缘。6.1.2 枝条上病斑症状为长椭圆形，黑褐色，中间浅灰，病部稍凹陷。受害果实产生近圆形斑点，后期病部变灰白色至浅红褐色。6.2 病原特征6.2.1 在显微镜下观察菌丝无色，有分隔，菌丝细胞双核并具典型的锁状联合体菌丝。在 P DA培养基中，菌丝初呈白色，成放射状紧贴着培养基表面向四周扩展，气生菌丝少，培养3d 后中央开始产生黄色色素，然后产生黄色的芽袍6.2.2 菌落的生长速率平均为0.3 5 c m/d o菌落在培养后期产生一些颗粒状黄色的菌丝团。该病原的菌丝和芽抱在黑暗的环境中都能发出生物荧光。6.2.3 无性生殖体的芽抱小，黄色、针状，由芽抱的茎和芽抱体组成，茎细长圆往状，长约 2 mm,茎的顶部长有飞碟状的芽抱体。芽抱体展开时，直径约。.3 3 m m，表面中间稍凹陷。芽抱体易脱落，萌发时边缘长出放射状有分隔的侵染丝(侵染体)。6.2.4 有性生殖体的担子果黄色，由 菌柄和菌盖组成，形状如微型的 小伞。菌柄直立，黄色，有细小绒毛，长。.6 c m-1.4 c m。连接菌柄的菌盖，黄色、半球形、伞面状，菌体薄、膜质、中间稍凹陷，边缘扁平、S N/T 1 4 5 0-2 0 0 4光洁、可透光。菌盖直径。.8 m m-4.3 mm、通常 2.0 mm,辐射状条纹 7 条-1 5 条。菌褶少，离得较开，黄色，有蜡质。担子棍棒状，(1 4.0 p m-1 7.4 p m)X5 p m。担抱子非常小，椭圆形或卵形，无色，(4 p m-5 p m)X(2.5 p m-3.0 p m),7 结果判定 如病原菌可产生生物荧光，其症状特征和病原特征符合 6.1,6.2 项的特征描述，鉴定为咖啡美洲叶斑病。必要 时，按 5.5项进行致病性试验。8 菌株的保存 将鉴定为咖啡美洲叶斑病的菌株移至装有 P D A培养基的试管内，放 1 5 条件下保存，定期(两个月)转管。菌株至少需保存十二个月，保存期满后，需经灭菌处理。S N/T 1 4 5 0-2 0 0 4 附录A (资料性 附录)咖啡美洲叶斑病的分布范围 哥斯达黎加、巴拿马、尼加拉瓜、危地马拉、萨尔瓦多、古巴、洪都拉斯、特立尼达和多巴哥、多米尼加、波多黎各、牙买加、海地、圭亚那、苏里南、墨西哥、玻利维亚、巴西、秘鲁、委内瑞拉、哥伦比亚、美国(佛罗里达、夏威夷)、瓜德罗普岛、马提尼克岛、西印度群岛。附录B (资料性附录)一些咖啡美洲叶斑病 的主要寄主小果咖啡C of f e a a r a b i c a中果咖啡C of f e a c a n e p h o r a大果咖啡C of f e a l i b e r i c a咖啡C o f f e a s t e n o p h y l l a正金 鸡纳 树C i n c h o n a o f f i c i n a l i s甜橙 Ci t r u s s i n e n s i s辣椒C a p s i c u m f r u t e s c e n s可可 T h e o b r o ma c a c a o牛心番荔枝 A n n o n a r e t i c u l a t a榕树 Fi c u s c o l u b r i n e a;F.t o r r e s i a n a果子曼G u z m a n i a蕉芋 Ca n n a e d u l i s肖竹竿 C a l a t h e a wa r s c e w i c x i i竹竿 Ma r a n t a a r u n d i n a c e a花烛A n t h u r i u m m y o s u r o i d e s五彩竿 C a l a d i u m s p龟背竹M o n s t e r a g i g a n t e a;M.P i t t i e r i三裂喜林芋 P h i l o d e n d r o n t r i p a r t i t u m西番莲P a s s i f l o r a c o r i a c e a蒲桃E u g e n i a j a m b o s秋海棠B e g o n i a i n v o l u c r a t a;B.p i t t i e r i鳄梨 P e r s e a a me i c a n a;P.c a e r u l e a大胡椒 P o t h o mo r p h e u m b e l l a t a