SNT 1569-2005 进出口河豚中河豚毒素检验方法 ELISA法.pdf

SN/T1569-20054.5.2试样保存处理后的样品如不能及时检测，可取10g已均质待测样品加入10mL的0.1%乙酸溶液，置于4保存。4.5.3包被将BSA-HCHO-TTX用0.05mol/LPBS稀释至20g/mL,包被酶标板，每孔加100L,4过夜，倒净孔内溶液，加3mg/100mL的牛白蛋白于20士1封闭30min,用PBST洗板3次，每次3min,待用。4.5.4酶标抗体浓度的选择将购置的酶标抗体用0.05mol/LPBS稀释至100倍、500倍、1000倍和2000倍，与40g/mLTTX标准溶液等量混合，按4.5.6检测A值。A值为0.3左右的酶标抗体浓度为酶标抗体的工作浓度。4.5.5校正曲线的制备4.5.5.1用0.05mol/LPBS稀释TTX标准储备液至5g/mL、0.5ag/mL、0.05g/mL、0.0254g/mL、0.01g/mL,制成5个浓度的TTX标准溶液。4.5.5.2取各浓度的TTX标准溶液100aL,分别与100uL已选定工作浓度的McAb-HRP充分混合，置4过夜或37士12h备用.4.5.5.3取上述不同浓度的混合液100L,分别加入已包被的酶标板，置37士11h。4.5.5.4洗板：用PBST洗板5次，每次3min。4.5.5.5显色：每孔加0PD底物液100L,37置暗处30min。4.5.5.6终止显色：每孔加50L终止液。4.5.5.7测定：于490nm处测定每孔的A值。4.5.6样品测定4.5.6.1取毒素提取液100L加已选定工作浓度的McAb-HRP100uL,充分混合，置4过夜，或3712h备用。4.5.6.2取上述混合液100L加入已包被TTX的微孔板，同时选择一孔加1g/mLTTX标准溶液为阳性对照，一孔加0.05mol/LPBS为阴性对照，置37士11h。4.5.6.3洗板：用PBST洗板5次，每次3min。4.5.6.4显色：每孔加OPD溶液1004L,37置暗处30min。4.5.6.5终止显色：每孔加50L终止液。4.5.6.6测定：于490nm处测定每孔的A值4.6绘制校正曲线以百分比吸光度值（算术级）为纵坐标，以TTX浓度(g/kg)(对数值)为横坐标，绘制出TTX标准液百分比吸光度值与TTX浓度（对数值）的校正曲线。每次试验均应重新绘制校正曲线。4.7结果计算按式(1)计算试样中河豚毒素含量：X=CXDXE4(1）VXW式中：X试样中河豚毒素的含量，单位为纳克每克(g/g);C一酶标板上测得的TTX含量，单位为纳克(g),根据工作曲线求得；D一试样提取液的体积，单位为毫升(mL)；E一试样提取液的稀释倍数；V一酶标板上每孔加人的样液体积，单位为毫升(mL)；3