SNT 1155-2002 植物检疫 玉米霜霉病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N I T 1 1 5 5-2 0 0 2 植 物 检 疫玉米霜霉病菌检疫鉴定方法 P l a n t q u a r a n t i n e-Me t h o d s f o r q u a r a n t i n ea n d i d e n t i f i c a t i o n o f P e r o n o s c l e r o s p o r a(l t o)C.G.S h a w2 00 2 一 1 1 一 2 5发 布2 0 0 3 一 0 5 一 01 实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 5 5-2 0 0 2目次前言 。，。，一I1 范围 ，12 原理 ，一13 仪器和用具 ，14 试剂和材料 15 现场检疫与取样 。，26 实验室检验 ，37 结果评定 ，58 样品保存 。，5附录A(资料性附录)玉米霜霉病菌寄主范围 6附录 B 资料性附录)D N A提取、扩增与电泳，7附 录C(规 范 性 附 录)P C R 扩 增引 物 .“一 二 “9附录 D(资料性附录)玉米霜霉病菌卵抱子、分生抱子、分生抱子梗图 1 0S N/T 1 1 5 5-2 0 0 2.几 J.叫.-月 Ili昌本标准的附录C为规范性附录，附录A、附录 B、附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人:李德福、郭琼霞、陈艳、张广志、张晓燕。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 5 5-2 0 0 2 植 物 检 疫玉米霜霉病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了植物检疫中玉米霜霉病菌检疫和鉴定方法。本标准适用于玉米、甘蔗、高粱及其他寄主中玉米霜霉病菌的检疫和鉴定。2 原理 玉 米霜霉病主 要由高粱霜霉病菌(P e r o n o s c l e r o s p o r a s o r g h i)、甘蔗霜霉病菌(P.s a c c h a r i)、菲律宾霜霉病菌(P.p h i l i p p i n e n.s i s)和爪哇霜霉病菌(P.m a y d i s)引起，该类病菌(以下简称玉米霜霉病菌P e r o n o s c l e r o s p o r a s p p.)属鞭毛菌亚门(Ma s t i g o my c o t i n a),梦 p 菌纲(O o my c e t e s),霜霉目(P e r o n o s p o r a-l e s),霜霉科(P e r o n o s p o r a c e a e)、霜指霉属(P e r o n o s c l e r o s p o r a)。玉米霜霉病菌除危害玉米外，还侵染其他植物(参见附录A)。一般情况下玉米霜霉病菌引起系统性侵染，有时也引起局部侵染，受侵染的玉米叶片出现边界明显的失绿，后期形成褐色坏死条斑。在温度 1 7 C 2 9 C、环境湿润条件下，叶背面病斑长出一层白色霉状物，即玉米霜霉病菌分生抱子和抱子梗。该病菌分生抱子及袍子梗形态、分生抱子萌发情况、卵抱子形成情况、P C R特异性反应等特征是玉米霜霉病菌鉴定特征。3仪器和用具3.1 显微镜、体视显微镜。3.2 P C R仪、电泳仪。3.3 冷冻高速离心机、台式微量离心机。3.4 普通冰箱、低温冰箱、恒温恒湿培养箱。3.5 普通天平(感量为 1/1 0 0),3.6 超净工作台。3.7 可调微量加样器。3.8 E p p e n d o r f 管(1.5 mL,0.5 mL),Oa k R i d g e 离心管(3 0 ml,).39 镊子、扁头牙签。3.1 0 载玻片、盖玻片、培养皿(直径为 1 5 c m-2 0 c m),3.1 1 铝铂纸或 P a r a f i lm膜。4 试 剂和材料4.1 三(经甲基)氨基甲烷(C,H NO,)4.2 乙二胺四乙酸(C,H,N,0,)4.3 十二烷基硫酸钠(C H_),O S 0 3 N a 4.4 2-琉 基乙醇(C,Hs OS)4.5 异 丙醇(C,Hs 0)4.6异戊 醇(C,Hio 0)4.7 乙醇(C H,C H,O H)4.8澳酚蓝(Cry H,a O,Br,S)S N/T 1 1 5 5-2 0 0 24.9 苯胺蓝(C,H N,HC D4.1 0 甘油(C H,O H C H OH C H,OH)4.1 1 二甲苯苯胺(C 8 H N)4.1 2 苯(C,Hs)4.1 3 乙酸钠(C H,C OO Na)4.1 4 醋酸钾(CH,C O OK)4.1 5 三氯甲烷(CH C I,)4.1 6 氯化钠(N a C U4.1 7 氯化钾(K C U4.1 8 抓化镁(M9 02)4.1 9 氢氧化钠(N a OH)4.2 0 4 种脱氧核昔三磷酸(d NT P)4.2 1 T a y D N A聚合酶4.2 2 核糖核酸酶 R N a s e A4.2 3 嗅化乙锭(CH=B r C H,B r)4.2 4矿物油4.2 5吐温-2 04.2 6 琼脂粉4.2 7 液态氮M)4.2 8 1 k b D N A(浓度为 2 5 n g/p L)5 现场检疫与取样51 现场检疫 现场核对货物有关单证，核实产地、包装、唆头、品名及数量。仔细检查进境玉米霜霉病菌寄主种子或原粮中是否夹带高粱、甘蔗叶片病残体，是否夹带带颖壳的高粱种子;检查进境甘蔗插条和其他玉米霜霉病菌寄主种苗叶片是否有可疑病斑。将检获物一并带回实验室内检验。52 原粮和种子取样5.2.1 原始样品和复合样品制备 船运散装进境的玉米霜霉病菌寄主种子或原粮，分船舱、分层次、分品种按棋盘式 3 0 个一5 0个点扦取原始样品，每份原始样品的质量应不少于 5 0 g;并制成复合样品，每份复合样品的质量应不少于1 5 0 0 g o 其他方式进境的玉米霜霉病菌寄主种子或原粮，以车、车皮或其包装为单位扦取 1 份复合样品.每份复合样品的 质量应 不少于1 5 0 0 g;少于1 5 0 0 g 全部取样检验.其他也按本标准执行。522 船运散装原粮和种子的取样次数 第一次取样，卸货前在表层进行:第二次取样，卸货三分之一时进行;第三次取样，卸货三分之二时进行每次取样各制备复合样品 1 份。5.2.3 一般包装玉米霜霉病菌寄主种子或原粮的取样份数和重IR5.2.3.1 取样份数 1 0 k g 1.i 下取 1 份:1 1 k g-1 0 0 k g 取 2 份;1 0 1 k g 一5 0 0 k g 取3 份;5 0 1 k g-1 0 0 0 k g 取4 份;1 0 0 1 k g-2 0 0 0 k g 以下取5 份;2 0 0 1 k g-5 0 0 0 k g 取6份;5 o 0 1 k g-i o o o o k g 取 7 份;1 0 0 0 1 k g以上.每增加 1 0 0 0 0 k g增取 1 份样品，不足 1 0 0 0 0 k g 的余量，计取 1 份样品。5.2.3.2 取样重量 I,-来每份样 品质量 为 2 5 0 0 ,其他玉米雳霉病 菌寄 卞每份样 品质量为 2 0 0 0 eS N/T 1 1 5 5-2 0 0 25.3 种苗、甘蔗插条取样5.3.1 取样份数 1 0 0 条(株)以下取 1 份;1 0 1 条(株)-5 0 0 条(株)取 2 份;5 0 1 条(株)-2 0 0 0条(株)取 3份;2 0 0 1条(株)5 0 0 0条(株)取4份;5 0 0 1 条(株)以上每增加5 0 0 0 条(株)增取 1 份样品，不足 5 0 0 0条(株)的余数计取 1 份样品。5.3.2 取样数f 甘蔗插条每份样品为 1 0 条，其他玉米霜霉病菌寄主种苗每份样品为2 0 株。不足每份样品数量的，全部扦样检验。5.4 样品登记 扦取样品必须登记。登记项目包括船名及层次、发货港、原产地、品种、扦样时间、样品编号、扦样员姓名等。6实验室检验6.1 原粮和种子洗涤检验 将每份复合样品充分混匀，制 成平均样品。从各平均样品中称取5 0 g,置于2 5 0 m L 三角瓶内，加人 1 0 0 m L蒸馏水，再加吐温-2 0 1滴-2滴，用铝铂纸或 P a r a f i l m膜将三角瓶封口，在振荡器上振荡5 m i n，将洗涤液移人离心管，以 1 0 0 0 r/m i n离心 5 mi n，倾去上清液，再加人剩余洗涤悬浮液，直至所有悬浮液离心完毕，用无菌水将沉淀物定溶至 1 mL-3 mL，取沉淀物悬浮液至载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜检查有无玉米霜霉病菌卵抱子，每批样品至少检查 5 个玻片。如镜检发现卵抱子，可按第6.4.2 条进行 P C R检测。6.2 寄主叶片和种子颖壳等病残体检验6.21 病斑检查6.2.1.1 病叶检查 在光线充足处，逐片检查高粱、甘蔗等寄主叶片有无褐色坏死条状病斑。6.2.1.2 高粱种子颖壳检查 在体视显微镜下，检查高粱种子颖壳有无褐色坏死病斑。6.2.2 病菌检验6.2.2.1 直接镜检 用镊子取小片病叶，放在载玻片上，加一滴无菌水，用扁头牙签剥离叶肉，放在低倍显微镜下，观察叶肉中的卵抱子。如镜检发现卵抱子，可按第 6.4.2 条进行 P C R检测。6.2.2.2 组织透明法检验卵抱子 选取带颖壳病高粱种子或病叶置于烧杯中，加人5%氢氧化钠和。.0 1 5%苯胺蓝，常温 下放置2 4 h后，用纱布过滤清水冲洗后，去种子胚乳，滤下物加适量无菌水，将悬浮的颖壳、种皮、病叶置于显微镜下观察，观察其中卵抱子。如镜检发现卵抱子，可按第6.4.2 条进行P C R检测。6.3 种苗检验 检查种苗叶片有无失绿、有无褐色坏死条斑等，如有褐色坏死条斑，可用第 6.2.2 条方法镜检褐色坏死斑有无病菌卵抱子。对失绿叶片，需作保湿检查:将病叶展平，放人预制的铺有三层湿滤纸的培养皿中，加盖后置于2 1 0C,1 0 0%R H条件下无光照诱发培养，5h 后每隔 3 0 m i n观察一次，连续观察6 h,观察分生抱子及其抱子梗形成、形态，观察分生抱子萌发过程。观察时，用镊子从叶背面取小片肉眼可见的白色霉层叶片，放在载玻片上，加一滴苯胺蓝染色液，立即用无菌水冲洗，再用吸水纸吸干多余的染色液，加上盖玻片在显微镜下观察。S N/T 1 1 5 5-2 0 0 26.4 P CR检 测6.4.1 病叶、种子及其领壳中提取D N A 取0.7 5 g 新鲜病叶、0.2 g干病叶、1.0 g表面带菌种子或带颖壳病种子，从中提取 D N A(参见附录B)，并将 D N A置于一2 0 保存备用。6.4.2 P CR扩增6.4.2.1 引物及待扩增 D N A 扩增引物 3种，其中 Ge n u s-1与 Ge n u s-2是玉米霜霉病菌 D N A 的特异性 引物，S o r g h i-1与S o r g h i-2 是高粱霜霉病菌 D N A的特异性引物，I T S-1 与 I T S-2是 I T S区域通用引物(见附录 C),P C R扩增的D N A样包括待检测D N A,阳 性对照 高粱霜 霉病菌D N A和阴 性对照S c l e r o s p o r a s p p.D N A,6.4.2.2扩增 利用上述 3 种引物，将待扩增 D NA样分别进行 P C R扩增。扩增时，设置超纯水空白对照和采用通用引物 I T S-1 与 I T S-2预防假阴性现象，并按条件 9 4 变性 1 m i n-5 0 退火 2 m i n-7 2 C延伸3 mi n，循环处理 3 0次，最后在 7 2 下延伸 7 m i n，完成 P C R扩增(参见附录 B)，但用引物 I T S-1 与I T S 2 扩增时，退火温度改为3 7 C，其他条件不变。扩增后产物置于一2 0 保存备用。6.4.3琼脂糖凝胶电泳 将每个P C R扩增产物和 1 k b标