SNT 1162-2020 传染性胰脏坏死病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 11622020代替 SN/T 11622002传染性胰脏坏死病检疫技术规范Quarantine protocol for infectious pancreatic necrosis中华人民共和国海关总署发 布ICS 65.150CCS B 502020-12-30 发布2021-07-01 实施ISN/T 11622020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件代替 SN/T 11622002传染性胰脏坏死病毒（IPNV）酶链免疫吸附试验（ELISA）诊断方法。本文件与 SN/T 11622002 相比，主要技术变化如下：增加了临床症状的描述；增加了 SYBR Green 荧光 RT-PCR 方法；增加了 RT-PCR 方法；修改了综合判定。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。本文件主要起草人：刘荭、郑晓聪、刘莹、王津津、贾鹏、温智清、何俊强、于力、史秀杰、兰文升、王红英、叶奕优。本文件所代替文件的历次版本发布情况为：SN/T 11622002。1SN/T 11622020传染性胰脏坏死病检疫技术规范1范围本文件规定了传染性胰脏坏死病毒的分离、SYBR Green 实时荧光逆转录聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验的检测方法。本文件适用于传染性胰脏坏死病的流行病学监测、检测与检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088出入境动物检疫采样3术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件：BSA：牛血清白蛋白（bovine serum albumin）；BF-2：蓝鳃太阳鱼细胞系（blue fin fish cell line）；CHSE-214：大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系（chinook salmon embryo cell line）；Ct：循环阈值（cycle threshold）；DEPC：焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate）；dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate）；ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）；HRP：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）；OD 值：光密度值（optic density value）；RNA：脱氧核糖核酸（ribonucleic acid）；RTG-2：虹鳟性腺细胞系（rainbow trout gonadal cell line）；RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）。4概述传染性胰脏坏死病（infectious pancreatic necrosis,IPN）是由传染性胰脏坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus,IPNV）引起的一种危害极其严重的传染性、病毒性鱼类疾病，主要流行于鲑科鱼类的鱼苗和幼鱼（参见附录 A）。5试剂和材料5.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2DEPC 水：配制方法见附录 B 中 B.1 或购买商品化试剂。2SN/T 116220205.3IPNV 参考株。5.4细胞系：CHSE-214、RTG-2 或 BF-2 细胞系。5.5HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸。5.6兔抗 IPNV 参考抗血清。5.7羊抗 IPNV 抗体。5.8酶标羊抗兔 IgG：按照说明书使用。5.9引物：用 DEPC 水将每条引物配制成 100 mol/L 储存液，置-20 以下冻存；使用时，取适量配制成 20 mol/L 工作液，避免多次冻融。具体序列如下：IPNV F:5-ACTACGAACCCCCAGGACAAA-3；IPNV R:5-GTCTCGTCCTCTAGGCGGACGTA-3。用于 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR，扩增 IPNV VP2 基因中 122 bp 的片段。IPNV PrD1：5-AAAGCCATAGCCGCCCATGAAC-3；IPNV PrD2：5-TCTCATCAGCTGGCCCAGGTAC-3。用于 RT-PCR，扩增 IPNV NS 与 VP3 基因之间 174 bp 的片段。6器材和设备6.1酶标测定仪。6.2倒置显微镜。6.3恒温培养箱。6.4PCR 扩增仪。6.5凝胶成像仪。7IPNV 的分离与鉴定7.1采样取样数量按照 GB/T 18088 的规定执行。有临床症状的鱼，体长小于等于 4 cm 的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长 4 cm6 cm 的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于 6 cm 的鱼则取肝、肾和脾。无临床症状的鱼取肝、肾和脾；成熟的雌鱼还需取卵巢液。鱼卵则取卵壳。7.2样品处理应保持在 10 以下进行处理。先用组织研磨器将样品匀浆，再按 110 的最终稀释度悬浮于细胞培养液（见附录 B 中 B.2）中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须在细胞培养液中加入 1 000 IU/mL 青霉素和 1 000 g/mL 链霉素。于 15 下孵育 2 h 4 h 或 4 下孵育 6 h 24 h。7 000 r/min 离心 15 min，收集上清液。卵巢液不必匀浆，稀释 2 倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。7.3病毒分离对 1:10 的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次 10 倍稀释，然后将 1:10、1:100、1:1 000 3 个稀释度的上清液，用无菌操作方法，以适当的体积分别接种到生长约 24 h 的 CHSE-214、RTG-2 或BF-2 细胞单层中，每孔（2 cm2）的细胞单层最多接种 100 L 稀释液。15 20 吸附 0.5 h 1 h 后，加入细胞培养液。置于 18 2 培养。阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7 d 内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。3SN/T 11622020如果除阳性对照细胞外，被检匀浆上清稀释液的细胞培养中没有细胞病变（CPE）出现，则在培养 7 d 后还要用敏感细胞再进行传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物，以 7 000 r/min 4 离心 15 min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养 7 d，每天镜检。如果盲传后没有 CPE 出现，则结果判为阴性。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养或者盲传后的细胞培养中出现 CPE，应立即应用SYBR Green 实时荧光 RT-PCR、常规 RT-PCR 或 ELISA 等方法进行 IPNV 鉴定。CPE 表现为局部区域细胞开始裂解，周围细胞收缩变圆，逐渐发展，细胞最终全部脱落。如果阳性对照也未出现 CPE，则试验无效，必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查。7.4IPNV 的 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR 检测7.4.1设立对照每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照为不含 IPNV 的组织或细胞培养物；阳性对照为含 IPNV 的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。7.4.2RNA 抽提分别取 200 L 待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打 10 次20 次，室温放置 5 min；加入 200 L 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min；12 000 r/min 离心 10 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 放置 20 min；12 000 r/min 离心 10 min；弃上清液，沉淀用 1 mL 75乙醇清洗；8 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥 5 min；加 20 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。4 冰箱保存备用，RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。7.4.3反应体系在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 1 配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表 1IPNV SYBR Green 荧光 RT-PCR 反应体系（25 L）组分加样量/L终浓度10One Step RNA PCR Buffer 2.51MgCl2（25 mmol/L）55 mmol/LdNTPs（10 mmol/L each）2.51 mmol/LRNase Inhibitor（40 U/L）0.50.8 U/LAMVRTase1）（5 U/L）0.50.1 U/LTaq DNA 聚合酶（5 U/L）0.50.1 U/LIPNV F（20 mol/L）0.250.2 mol/L1）AMV RTase 具有耐受 60 高温的特性，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯一认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4SN/T 11622020组分加样量/L终浓度IPNV R（20 mol/L）0.250.2 mol/L10 x SYBR Green0.50.2RNase Free dH2O10模板/对照2.5将已加样的 PCR 反应管短暂离心后放入荧光 PCR 仪，扩增反应条件设定：60 反转录 15 min，94 预变性 2 min；94 变性 5 s，58 退火 20 s，72 延伸 35 s，40 个循环；在 72 延伸阶段设置采集荧光。7.4.4分析条件设定以综合分析仪器给出的各项结果、基线（baseline）以及仪器给出的默认值作为参考，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为原则，具体还需根据仪器噪音情况进行调整；选择 SYBR 通道进行分析。SYBR Green 实时荧光 RT-PCR 产物的特异性可用溶解曲线分析来确定。当扩增反应结束后，直接在荧光PCR仪上运行melting allias程序进行溶解曲线分析。程序的反应步骤：95 15 s；58 20 s，在 20 min 内温度上升至 95 并维持 15 s。7.4.5结果判定阳性对照 Ct 值小于或等于 30，有典型的扩增曲线，溶解曲线有明显的溶解温度；阴性对照和空白对照无 Ct 值或 Ct 值大于 35，无扩增曲线，溶解曲线无明显的溶解温度，结果成立。待测样品 Ct 值小于或等于 30，且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阳性。待测样品呈现无 Ct 值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阴性。对于 Ct 值大于 30、小于 40 的样品，应重新调整模板浓度后重复实验。重复检测样品 Ct 值小于或等于 30 且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阳性，否则判为荧光 RT-PCR 阴性反应。7.5IPNV 的 RT-PCR 检测7.5.1设立对照每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照为不含 IPNV 的组织或细胞培养物；阳性对照为含 IPNV 的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的RNA。7.5.2RNA 抽提分别取200 L待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物，加入1 mL Trizol试剂，用移液器充分吹打 10 次20 次，室温放置 5 min；加入 200 L 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min；12 000