SNT 1084-2010 牛副结核病检疫技术规范.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 ，和 牛副结核病检疫技术规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉狆 犪 狉 犪 狋 狌 犫 犲 狉 犮 狌 犾 狅 狊 犻 狊狅 犳犫 狅 狏 犻 狀 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准代替了 副结核皮内变态反应操作规程、副结核补体结合试验操作规程、副结核细菌学检查操作规程、副结核分枝杆菌 检测技术操作规程 和 牛副结核病酶联免疫吸附试验操作规程。本标准与 、和 相比，主要技术变化如下：参考 陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）年版 节副结核病（病）中部分的诊断技术；增添了临床诊断、显微镜检查、琼脂免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、探针捕获 方法、嵌套式 方法。本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检检验疫局、中华人民共和国沈阳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王伟利、姜焱、石建平、巩红霞、孟庆峰、霍蕾、王玉玲、肖成蕊、林颖、孟日增、刘和平、罗雁非、柏亚铎、宋战昀、廉慧锋、董志珍、侯艳梅。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：；。犛 犖犜 牛副结核病检疫技术规范范围本标准规定了牛副结核病的检疫技术规范。本标准适用于牛的副结核病病原和抗体的检验检疫以及牛副结核病的流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法临床诊断 总则副结核病（，）是由副结核分枝杆菌引起的反刍兽的慢性肠炎。根据该病的流行病学、临床症状和病理变化，可以作出初步诊断，但确诊需要通过实验室诊断。流行病学副结核分枝杆菌主要感染牛，特别是幼年牛更易感染发病。除牛外，绵羊、山羊、骆驼、猪、马、驴、鹿等动物也可感染。但因潜伏期长，可达个月 个月，甚至更长。有时幼年牛感染直到岁岁时才表现临床症状，在岁岁以后的任何年龄的牛均可发生本病，特别当牛怀孕、分娩或泌乳时易出现症状。病牛和隐性感染牛是传染源，它们可通过乳汁、粪便和尿排出大量病原菌。本病常呈散发或地方性流行，主要经消化道感染，也可通过子宫感染胎儿。该病的流行特点是发展缓慢，发病率不高，病死率高，感染牛群的死亡率可达，甚至可达。临床症状发病初期没有明显症状，以后症状逐渐明显，开始是间歇性腹泻，其后逐渐严重和频繁，重者粪便如水样，喷射状排出或稀粥样，含有蛋白凝块、气泡和多量黏液，偶见血丝。早期精神、食欲、泌乳无明显改变，以后食欲减退，精神不佳，泌乳减少或停止。患畜逐渐消瘦，体力不支，经常卧地。被毛粗乱，下颌及肉垂水肿。但体温常无变化。随腹泻症状的延续，则出现进行性的消瘦，直至死亡。病理变化早期病变发生在小肠壁和肠系膜淋巴结导管，随着病程进一步发展，在回肠、空肠、小肠后段、盲肠和结肠，以及肠系膜淋巴结出现肉眼可见病变。副结核病不能只根据对肠壁增厚的表面观察而作出诊断，对粘膜层尤其是回肠末端的粘膜，应作病理性增厚和皱褶病变检查，将肠壁拿到明亮处，看到分散的斑块时，即为感染早期的病变。将样品固定（福尔马林）后进一步做组织学检查，样品切片经苏木紫 伊红及萋 尼氏染色后检查，病理诊断性病变包括粘膜固有层浸润，淋巴集结和肠系膜淋巴结皮质有大的淡染上皮样细胞和多核朗罕氏巨细胞浸润，在这两种细胞中有成丛的或单个的抗酸染色菌存在。犛 犖犜 副结核分枝杆菌开始在病灶中出现，最后遍布全身。显微镜检查 设备、材料与试剂 设备显微镜、离心机、水浴槽。材料载玻片。试剂萋 尼氏染色试剂：配制及染色方法见 ，氢氧化钠溶液。实验用水应符合 规定。操作方法取待检粪样（尽可能取带有粘液或血丝的粪便）加入约倍量的 氢氧化钠溶液，混匀，水浴乳化 ，用纱布网过滤，取滤液 ，离心 ，去沉渣后，再以 离心 ，弃上清液，用沉淀涂片，也可以取直肠刮取物、病变肠段粘膜直接涂片。火焰固定，进行萋 尼氏染色、镜检。结果判定发现在细胞内有被染成红色、成丛、成团的抗酸小杆菌（个）即为细菌检查阳性，否则判为细菌检查阴性。细菌学检查 设备、材料和试剂 设备显微镜、离心机、水浴恒温培养箱、磁力搅拌器。材料载玻片、刮匙。试剂 脂肪酶（）。草酸 孔雀绿混合液（见 ）。两性霉素、新霉素混合液（见 ）。培养基（见），改良的 培养基（见）。氯化十六烷基吡啶（）、胰蛋白酶水溶液、氢氧化钠、酒精。犛 犖犜 采样、送检和处理 采样 乳汁常乳在分娩后 内收集。取乳样前，乳头用 的酒精擦洗消毒，弃去前几把始乳后，收集乳样 于无菌的容器里。粪便选取混有血液、粘膜的粪便或使用刮匙从动物直肠深部（约 ）取少量粘液粪便，盛于灭菌容器内，也可将上述材料直接涂片，干燥，镜检。肠段和淋巴结选取有明显病变的肠段、回盲瓣、肠系膜淋巴结以及其他出现病理变化的区域。样品处理 乳汁的处理取乳样 加 脂肪酶 消化，再加入等量的草酸、孔雀绿混合液充分混匀，水浴中放置 ，去除杂菌，并不时的振摇，离心 ，弃上清液，取沉淀物接种于 培养基或改良的 培养基。同时制成涂片，进行萋 尼氏法染色、镜检。粪便的处理将粪便放入盛 蒸馏水的试管中，室温振荡 ，静止 。取 上层悬浮液到盛 含 的试管中。颠倒混匀，室温静置，取试管底部沉淀作为待检物。肠段和淋巴结的处理肠段：刮取约粘膜；淋巴结：剔除外部脂肪后称取。放入盛 胰蛋白酶容器中，用的氢氧化钠溶液调 至，室温下磁力搅拌器搅拌 。消化后的混合物用纱布过滤，滤液以 离心 ，弃去上清液。将沉淀用 含 的 重新悬浮，室温下静置，试管底部沉淀为待检物。样品的培养取只含分枝杆菌素的 培养基（或改良的 培养基斜面）和只不含分枝杆菌素的 培养基斜面，分别接种 上述任一种处理过的待检物，接种物要均匀地接种到斜面上，将试管螺帽拧松后在 下按斜面角度放置。当水分从斜面上蒸发以后，将试管螺帽拧紧后垂直放置于 温箱中。每周观察斜面一次，连续观察 周 周。培养物的形态观察副结核分枝杆菌的初代培养会出现在接种后周 周内，在含有分枝杆菌素的 培养基上副结核分枝杆菌的初始菌落很小（直径），无色、半透明、半球状、边缘整齐、表面光滑、有光犛 犖犜 泽，随培养时间延长，菌落变大（），不透明，菌落的形态从光滑变为粗糙，从半球状变为乳头状。样品的镜检将上述沉淀物涂片作萋 尼氏抗酸染色，镜检可见到红色成丛、成堆排列（个以上）杆菌，视野中背景为蓝色。如一张标本能检出抗酸性杆菌的团块，则可怀疑为本病。结果判定如在含分枝杆菌素的 培养基或含分支杆菌素的改良 培养基上有菌生长，而在不含分枝杆菌素的培养基上无菌生长，镜检为抗酸染色阳性的红色成丛小杆菌，并出菌时间较长（周个月）时，即认为是副结核分枝杆菌。皮内变态反应试验（迟发型过敏反应，犇 犜 犎）材料与试剂 材料 注射器，适配针头（号号），游标卡尺、酒精棉球。试剂灭菌生理盐水，副结核分枝杆菌提纯蛋白衍生物（副结核 ）或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物（禽结核 ），使用前用生理盐水稀释使其最终浓度为 。由指定单位提供。操作步骤（两种接种途径）颈部接种将颈部（左侧或右侧）中三分之一处将毛剪净，剪毛区直径约 。将接种部位皮肤捏起，用卡尺测量捏褶皮肤的厚度，并做记录，皮厚单位用毫米（）表示。用酒精棉球消毒接种部位，用注射器吸取 副结核菌素，与接种部位呈 的角度进行皮内注射，注射部位应出现鼓包或隆起，若无小鼓包则应在另侧颈部相应部位再注射一次。如果注至皮下或溢出，应于离注射点 以外补注一针，并在记录中加以说明。尾根部接种将尾巴托起，在尾根（左侧或右侧）无毛的皱褶部进行皮内注射。接种方式同 。判定结果 在接种后分别于、检查注射部位有无热、肿、痛等炎性反应，并以卡尺测量接种部位捏褶皮肤厚度。颈部：接种后于 皮肤厚度减去接种前皮肤厚度，皮厚增加 以上时，迟发型变态反应阳性，皮厚差为阴性。尾根部：在接种后分别于、观察并触摸接种部位，进行终判，肿胀者为阳性，无肿胀者为阴性。犛 犖犜 聚合酶链（犘 犆 犚）反应（之一）设备、材料和试剂 设备 扩增仪、高速冷冻离心机、超净工作台、旋涡振荡器、凝胶成像分析系统、恒温水浴振荡器、磁力搅拌器、天平、消毒灭菌锅、高温干燥箱、冰箱。材料可调微量移液器（、）、离心管和吸头（用 水处理后高压灭菌备用）。试剂 缓冲液（）、缓冲液、溶菌酶、蛋白酶、蛋白酶、（见 ）。三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇。电泳缓冲液、琼脂糖凝胶、溴化乙锭溶液（见 ）。操作步骤 样品的制备 标准菌株副结核分枝杆菌由国家指定单位提供。粪便称取新鲜粪便，加 ，混匀，放置 或 室温离心 ，取上清液，室温放置 或 室温再次离心 ，取上清液，室温离心 ，弃上清液，加入 。奶样无菌操作取奶加 ，混匀，室温离心 ，弃上清液，管壁残留的奶样用灭菌的棉签擦掉，加入 。犇 犖 犃模板的提取 水浴加热 ，冷至室温。加 溶菌酶，气浴振荡培养。加 蛋白酶，混匀，水浴加热 。加 和 预热 的 ，上下颠倒混匀，直至液体变为白色（奶状），水浴加热 。加 三氯甲烷：异戊醇（），混匀，室温离心 。取上层水相于新管，加等体积的三氯甲烷异戊醇（），混匀，室温离心 。犛 犖犜 取上层水相于新管，小心加入 体积的异丙醇沉淀核酸，小心手摇混匀，放置 ，室温离心 。弃上清液，加入 预冷的 的乙醇，室温离心 ，弃上清液。小心吸走液体，室温下干燥 左右，用 溶解，保存。犘 犆 犚法 引物正向引物 ：反向引物 ：扩增副结核分枝杆菌基因中的 片段。扩增程序及反应条件 变性 ，退火 ，延伸 ，共 个循环。反应体系（犔）设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用副结核标准菌株的模板 作阳性对照，用其他非副结核杆菌的模板 做阴性对照，用水作空白对照模板。见表。表犘 犆 犚反应体系试剂名称用量 缓冲液（不含 ）氯化镁 犜 犪 狇酶 模板 补足至反应总体积为 注：反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。犘 犆 犚扩增产物电泳检测用 电泳缓冲液配制成琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度 ）。将平板放入水平电泳槽中，加入 电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将 扩增产物与上样缓冲液混合，加入样品孔中，取 加入到标准分子量对照孔内。恒压电泳 。凝胶成像分析系统检测并记录结果。结果判定及表述 后，阳性对照会出现一条 的 片段，阴性对照和空白对照没有核酸带，待检样品中如出现 的 片段为检测结果阳性，即检出副结核分枝杆菌。如未出现 的 片段犛 犖犜 为检测结果阴性，即未检出副结核分枝杆菌。序列参见附录。聚合酶链（犘 犆 犚）反应（之二嵌套式犘 犆 犚）设备、材料和试剂 设备 扩增仪、低温高速离心机、电泳仪、凝胶成像分析系统、冰箱、生物安全柜、电泳槽。材料可调微量移液器（、）、离心管和吸头（用 水处理后高压灭菌备用）。试剂 缓冲液（见 ）、缓冲液、溶菌酶、蛋白酶。苯酚三氯甲烷、三氯甲烷异戊醇、醋酸铵、异丙醇、乙醇。电泳缓冲液、琼脂糖凝胶、溴化乙锭溶液。标准菌种由指定单位提供。引物的设计针对 基因设计合成两对引物：第一次扩增：上游引物 ，下游引物：（片段大小为 ）；第二次扩增：上游引物 ，下游引物 （片段大小为 ）。引物均配制成 ，保存。细菌的培养按照 进行细菌培养。犇 犖 犃提取取菌苔（湿重）振荡悬浮于 溶液中，室温静置 ；离心 ，沉淀用 悬浮，离心 离心；沉淀用 悬浮，加 溶菌酶 下孵育 ，加入 蛋白酶 和 ，下孵育 ，观察是否透明，若不透明补加 ，下孵育 ；冰上冷却后，加入等体积的苯酚三氯甲烷摇动，离心 ；取上清液，加等体积的三氯甲烷异戊醇摇动 离心 ；取上清液，加等体积的 醋酸铵和倍体积的异丙醇，充分振荡后室温放置 ，离心 ；弃上清液，加入 乙醇，离心 ，弃上清液，室温干燥沉淀，溶于 灭菌去离子水中。嵌套式犘 犆 犚扩增 第一步反应 反应体系（）见表。犛 犖犜 表第一步反