SNT 0423-2010 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验 免疫学方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验免疫学方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳 狉 犪 犫 犫 犻 狋犺 犪 犲 犿 狅 狉 狉 犺 犪 犵 犻 犮犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲狏 犻 狉 狌 狊 犻 狀犲 狓 狆 狅 狉 狋 犻 狀 犵犳 狉 狅 狕 犲 狀狉 犪 犫 犫 犻 狋 狊犐 犿犿 狌 狀 狅 犾 狅 犵 狔犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 出口冻兔肉中“兔出血病”病毒检测方法。本标准与 相比，主要技术变化如下：修改标准的中英文名称，增加副标题；增加前言；将原标准的主题内容与适用范围改为范围；增加规范性引用文件；增加术语、定义和缩略语；增加抽验标准、方法；流程图、试剂的配制调整到附录、附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国连云港出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙晓斌、王维志、于维军、张敬友、潘荣生。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犛 犖犜 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验免疫学方法范围本标准规定了出口冻兔肉中兔出血病病毒样品的采集、检测方法和结果判定。本标准适用于出口冻兔肉中兔出血病病毒的检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。出入境动物检疫采样术语、定义和缩略语下列术语和定义及缩略语适用于本文件。术语和定义 兔出血病病毒 狉 犪 犫 犫 犻 狋犺 犲 犿 狅 狉 狉 犺 犪 犵 犻 犮犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲狏 犻 狉 狌 狊是导致兔发生兔出血病的病原，兔出血病是兔高度接触传染性、致死性疫病，世界动物卫生组织 和我国分别将之列入 疾病名录和二类动物疫病。缩略语 （）酶联免疫吸附试验（）血凝试验 （）血凝抑制试验（）间接血凝试验 （）间接血凝抑制试验器材与试剂 器材 分析天平（千分之一）。普通离心机（离心力 犵）。微型高速离心机（离心力 犵）。均质器。持针器。玻璃研磨器。犛 犖犜 微型振荡器。培养箱。微量移液器。血凝反应板。酶标反应板。酶标测定仪。试剂 鞣酸（分析纯）。磷酸氢二钾（分析纯）。磷酸二氢钾（分析纯）。磷酸氢二钠（分析纯）。柠檬酸（分析纯）。四甲基联苯胺（分析纯）。过氧化脲（分析纯）。硫酸（分析纯）。硫酸铵（分析纯）。聚乙二醇 。三氯甲烷（分析纯）。氯化钠（分析纯）。氯化钾（分析纯）。吐温 。小牛血清蛋白（）。卵清蛋白（）。乙酸钠（分析纯）。乙酸（分析纯）。人血红细胞悬液，见附录。经致敏的双醛化绵羊红细胞悬液，见附录。包被液（），见附录。液，见附录。洗涤液（），见附录。稀释液（保温液），见附录。底物液，见附录。醋酸钠柠檬酸缓冲液，见附录。终止液，见附录。兔出血病病毒阳性血清，见附录 。，见附录 。酶标记第二抗体，见附录 。样品采集 抽样标准按 的规定采样。犛 犖犜 抽样方法以同一检验检疫批为单位抽样，按规定的抽样件数，根据样点分布均匀化的原则，按棋盘式或对角线随机抽取。抽取的样品需在实验室进行如下处理：）冻带骨兔肉：每只被采集样品的兔体取胫骨两支，装入清洁的塑料袋中；）去骨兔肉：每件中剪取同一兔体肌肉 ，作为原始样品，混合后置于清洁容器内，作为混合原始样。混合原始样的质量不少于 。样品的标识和保存取代表性样品应保持冷冻状态，保证样品不受外界的污染，加贴标签和官方封识。样品应立即送到实验室进行检测，存查样品应存放在 的温度下保存，保存期至索赔期满为止。操作步骤 试样的制备 匀浆 骨髓试样以持针器夹碎胫骨取出骨髓。装入小型塑料离心管，称量。用倍量的 稀释。用玻璃研磨器研磨匀浆后装入玻璃瓶内。肌肉试样称量 肌肉，加入 。高速匀浆机匀浆 ，匀浆后装入三角烧瓶。冻融匀浆后试样置低温冰箱内反复冻融三次后，离心 取上清液。浓缩在所得上清液中，加入上清液量的聚乙二醇 ，并加氯化钠至，置冰箱过夜。悬浮浓缩过的样品液 离心 去上清液，沉淀物以少量 悬浮，成混悬液（肌肉样用，骨髓样用 ）。去杂在所得混悬液中加入四分之一体积的三氯甲烷，摇匀 离心 取水相，置冰箱冻结保存备用。犎 犃、犎 犐试验 血凝试验（犎 犃试验）在 孔型微量血凝反应板上，从第一孔至第十一孔，每孔加入 。然后在第一孔犛 犖犜 加入待检样品的浓缩液，从第一孔开始用移液器，作等量稀释至第十孔，最后一孔弃去。第十一孔是 对照，第十二孔加入 正常兔肝悬液 对照。每孔各加入人“”型红细胞，立即在微型混合器上摇匀，置室温。待对照孔血细胞完全沉积后观察结果。血凝效价表示方法，其中血凝程度以、表示：）“”：红细胞均匀铺于孔底；）“”：红细胞基本同上，但边境不整齐，有下垂趋向；）“”：红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝结块；）“”：红细胞于管底形成一个小团，但边缘不光滑，四周有凝结块；）“”：红细胞于孔底形成小团，边缘整齐，光滑。注：出现为其凝集终点。血凝抑制试验（犎 犐试验）在 孔型微量血凝反应板上，待检样品浓缩液稀释方法同上。一个样品做相同的两排。第一排每孔加 ，第二排每孔加阳性血清 摇匀，温箱放置 。各孔加入人“”型红细胞，立即在微型混匀器上摇匀，置室温。待对照孔红细胞完全沉淀后观察结果。结果判定中，血凝效价表示方法同 。与 试验两排孔的血凝效价相差两个滴度以上者则为阳性。犐 犎 犃及犐 犎 犐试验 间接血凝试验（犐 犎 犃试验）反应在 孔型微量血凝反应板上进行。根据被检材料的份数，按每份材料一排孔安排，在反应板上依顺序编号。于计划各排的每孔中加 稀释液。取被检材料，对号加入该排第一孔，逐孔向后做倍比稀释至倒数第二孔为止，最后一孔为稀释液对照。每板设已知阳性、阴性抗原对照各一排。每孔加致敏血球，移反应板于混匀器上中速摇振至红细胞分散均匀（约 ），然后将反应板置 温箱，经 后观察结果。凝集效价表示方法：）“”：红细胞均匀铺于孔底；）“”：孔内凝结团大于孔面积，未遍及全孔者；）“”：红细胞少许沉积孔底，周围有混浊带约占孔面积；）“”：红细胞大部分沉积孔底，沉淀边缘模糊者；）“”：红细胞于孔底形成小团，边缘整齐，光滑。注：结果以“”为凝集终点。间接血凝抑制试验（犐 犎 犐试验）每份样品按两排孔安排，操作同前，唯 排每孔加 的阳性血清，而 排每孔增加稀释液，振荡均匀后，将反应板置 温箱中经 判定结果。结果判定中，与 试验两排孔的血凝价相差两个滴度以上者为阳性。犛 犖犜 犈 犔 犐 犛 犃试验 将提纯抗体用包被液作 稀释后加入酶标反应板，每孔 。包被后置 冰箱过夜。取出包被的反应板用洗涤液洗三次，每次 （每次加洗涤液后，放置 再倾去），将板甩干拍净。用稀释液将待检浓缩液作和稀释，每个检样的两种稀释液分别各加入两个孔，每孔 ，每块板同时加阳性，阴性样品各两孔，作对照用，每块板同时加两孔稀释液留作空白对照，置 温箱 。取出反应板用洗涤液洗三次，方法同 。各孔加酶标第二抗体 ，置 温箱 。取出反应板用洗涤液洗三次，每次 ，将板甩干拍净。每孔加底物液 ，置 温箱 。要求避光。取出反应板，每孔加终止液 终止反应。测定光密度值或目测。结果判定以酶标测定仪测定 值。若待检样品 值与已知阴性样品 值之比（犘犖）时，判定为阳性，否则为阴性。若目测，凡是待检孔的颜色比阴性孔深者为阳性，否则为阴性。如果采用商品化试剂盒按试剂盒规定的方法检测。报告结果报告阳性结果。、试验，、试验及 试验。三者任选一种检测方法进行检测，凡出现阳性者均可报告阳性结果。否则判为阴性结果。检验流程见附录。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）试 剂 配 制犃 人血红细胞悬液新鲜人血红细胞（型）用 倍量生理盐水洗涤三次，最后以 离心 ，吸取压积细胞用生理盐水配成悬液。犃 犿 狅 犾犔狆 犎 犘 犅 犛溶液称取氯化钠（），氯化钾（），磷酸氢二钠（），磷酸二氢钾（），定容至 双蒸水中，保存于室温或冰箱中。犃 经致敏的双醛化绵羊红细胞悬液以 双醛化绵羊红细胞的致敏为例。双醛化绵羊红细胞离心，去上清液，用 ，洗一次，离心 ，去上清液，加入 生理盐水，鞣酸，水浴 ，离心 ，去上清液，加入 ，乙酸缓冲液，水浴 。离心 ，去上清液，用 生理盐水洗三次，用 ，的 配制成血球悬液备用。犃 包被液（犆 犅，狆 犎 ，犿 狅 犾犔碳酸盐缓冲液）碳酸钠（）、碳酸氢钠（）加双蒸水溶解至 。犃 洗涤液（犘 犅 犛 犜，狆 犎 磷酸盐缓冲液 吐温）氯化钠（）、磷酸氢二钠（）、磷酸二氢钾（）、氯化钾（）、吐温 加双蒸水溶解至 。犃 稀释液（保温液犘 犅 犛 犜 犗 犞 犃）于 内加入卵清蛋白使其浓度为。犃 底物液犃 （四甲基联苯胺）溶于 二甲亚砜中，避光保存，备用（可保存个月）。犃 过氧化脲溶于 ，的醋酸钠柠檬酸缓冲液中，避光保存，备用（可保存个月）。犛 犖犜 犃 临用前取按 要求所制溶液 ，溶入到 按 要求所制溶液中，随即加入 双蒸水混匀。犃 狆 犎 ，犿 狅 犾犔醋酸钠柠檬酸缓冲液 醋酸钠加 柠檬酸缓冲液。犃 终止液于 双蒸水中缓慢加入 浓硫酸（），混匀。犃 兔出血病病毒阳性血清（犚 犎 犇 犞）的制备取健康兔，肌肉注射本病毒疫苗。然后分别在第 天、第 天时注射强毒，最后一次注射后 试血，当 效价达到 时采血清即得。犃 犚 犎 犇 犞 犐 犵 犌的制备与纯化取 阳性血清用等量的饱和硫酸铵盐析沉淀三次后，再以三分之一量的饱和硫酸铵盐析沉淀两次，最后再经 或 层析后得到较纯化的 。犃 酶标记第二抗体（市售）酶标记羊抗兔 ，工作效价 或酶标记葡萄球菌蛋白，工作效价。犛 犖犜 书书书犛 犖犜 附录犅（规范性附录）出口冻兔肉中兔出血病病毒检验流程图图犅 出口冻兔肉中兔出血病病毒检验流程图犜犖犛书号：定价：元