SNT 0184.3-2008 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 免疫磁珠法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第部分：免疫磁珠法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犔 犻 狊 狋 犲 狉 犻 犪犿 狅 狀 狅 犮 狔 狋 狅 犵 犲 狀 犲 狊犻 狀犳 狅 狅 犱犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犘 犪 狉 狋：犐 犿犿 狌 狀 狅 犿 犪 犵 狀 犲 狋 犻 犮犫 犲 犪 犱 狊犪 狊 狊 犪 狔 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书前言本部分的附录、附录均为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、李振荣、胡传伟、王玉萍、蒋维旗。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第部分：免疫磁珠法范围 的本部分规定了进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌取样、制样和免疫磁珠检测方法。本部分适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。规范性引用文件下列文件中的条款通过 本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。实验室生物安全通用要求 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法方法概述将直径 具有磁性的微珠的表面化学修饰，并与李斯特氏菌特异性抗体结合，制成免疫磁珠，它能与食品中李斯特氏菌抗原结合，从而检出食品中的李斯特氏菌。样品经 增菌后，分别取 增菌液和 免疫磁珠加入带盖塑料管中，在磁板背景下混合，如果有李斯特氏菌抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，然后利用磁性将免疫磁珠聚集，经清洗后接种到显色培养基和任选一种培养基（或 琼脂），对于选择性分离平板上典型李斯特氏菌菌落进行确认，最终通过系列试验确定是否存在单核细胞增生李斯特氏菌。设备和器具 培养箱：；。水浴锅：。微量移液器：，。刻度移液管：、。灭菌玻璃器具：量筒、三角烧瓶、培养皿（直径）、试管。灭菌管（管）：。抗李斯特氏菌免疫磁珠：该磁珠可以通过商业途径获得。应准确地按照生产商的说明书进行操作。旋涡混合器。带有磁架的磁性分离器。培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。胰酪大豆肉汤（）：见第 章。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售 胰酪大豆琼脂（）：见第 章。肉汤增菌液（，）：见第 章。琼脂：见第 章。琼脂：见第 章。显色培养基。注：本部分使用的培养基为 公司产品，其他公司的等效显色培养基应验证后使用。磷酸盐缓冲溶液（）：见第 章。参考菌株：单核细胞增生李斯特氏菌（）。检验步骤 样品制备在均质袋中加入 样品，再加入 增菌肉汤（见），培养。增菌取 中制备好的样品，加到 增菌液（见）中，培养 后，进行免疫磁珠分离。免疫磁珠分离（犐 犕 犛）免疫捕获混合 增菌培养液，沉淀所有的粗糙食物残渣，从增菌培养液中移取 上层液体（要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒）加入 管（见）中，加 准备好的免疫磁珠（见）。在旋涡混合器（见）上混合该悬液。分离将 管固定在磁架（见）的管孔中，轻缓摆动磁架次次，使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的 管管盖，从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠，每一个样品换一次枪头；加 灭菌的 （见），并重新盖好盖子，将磁极从支架上移走，轻缓摆动磁架次次，使管内各成分混合，然后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开，并加 灭菌的 （见）到管中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器，也可以用手摇代替。分离培养 分离培养吸取 免疫磁珠悬液，加到显色培 养 基（见 ）及 任 一 选 择 性 培 养 基 （见 ）、（见）琼脂平板上，用无菌接种环划线，培养 。筛选李斯特氏菌在 显色培养基上菌落为蓝色，且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在 琼脂平板上生长 后菌落呈现黑色，直径为，在其周围形成一个黑色环，培养，菌落仍呈黑色，直径，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在 琼脂平板上与在 琼脂平板上菌落相似。在 显色培养基及 或 琼脂平板上挑取个或更多可疑菌落，接种于 琼脂（见）平板上，纯培养后进鉴定。鉴定和确认单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定和确认按 执行，单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图见附录。质量控制每次检验均应用单核细胞增生李斯特氏菌（见）进行质量控制。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售结果判定 凡通过本方法在被检食品中分离获得的纯菌落，各项生化试验结果均符合 所规定的生化特征，报告为在 被检食品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。各项生化试验结果不符合 所规定的生化特征，报告为在 被检食品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。安全防护单核细胞增生李斯特氏菌为生物安全二级病原微生物。微生物检测实验室的工作人员对该菌进行检验时，应遵守 中关于实验室生物安全防护的要求。易被其感染的年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者应远离单核细胞增生李斯特氏菌分离、鉴定和确认的试验场所。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 胰酪胨大豆肉汤（犜 犛 犅 犢 犈）犃 成分胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）植物蛋白胨 氯化钠 磷酸二氢钾 葡萄糖 酵母浸膏 蒸馏水 犃 制法将上述各成分加热煮沸溶解冷却后，调 至 ，分装，灭菌 ，备用。犃 胰胨大豆琼脂（犜 犛 犃 犢 犈）犃 成分胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）植物蛋白胨 氯化钠 酵母浸膏 琼脂 蒸馏水 犃 制法除琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调 至 ，再加入琼脂，灭菌 ，备用。犃 犉 狉 犪 狊 犲 狉肉汤增菌液（犉 犅，犉 犅）犃 基础肉汤犃 基础肉汤成分酪蛋白酶消化物 动物组织酶消化物 牛肉浸膏药 酵母浸膏 氯化钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 七叶苷 氯化锂 蒸馏水 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售犃 制法将上述成分置于 水浴中充分溶解，冷却后调 至 ，分装，灭菌 。犃 盐酸吖啶黄溶液盐酸吖啶黄 灭菌蒸馏水 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌，避光保存。犃 萘啶酮酸钠盐溶液萘啶酮酸 氢氧化钠溶液 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。犃 犿 狅 犾犔氢氧化钠溶液氢氧化钠 灭菌蒸馏水 振摇混匀，充分溶解。犃 柠檬酸铁铵溶液柠檬酸铁铵 灭菌蒸馏水 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。犃 犉 狉 犪 狊 犲 狉 犿肉汤犉 犅增菌液犃 犉 狉 犪 狊 犲 狉 犿肉汤犉 犅增菌液成分盐酸吖啶黄溶液 萘啶酮酸钠盐溶液 柠檬酸铁铵溶液 犃 制法将 中各成分按上述体积加入到 基础肉汤中，无菌分装于 ，大试管中备用。犃 犉 狉 犪 狊 犲 狉 犿肉汤犉 犅增菌液犃 犉 狉 犪 狊 犲 狉 犿肉汤犉 犅增菌液成分盐酸吖啶黄溶液 萘啶酮酸钠盐溶液 犃 制法将 中各成分按上述体积加入到 基础肉汤中，无菌分装于 大试管中备用。犃 犗 犡 犃琼脂犃 成分蛋白胨 淀粉 氯化钠 柠檬酸铁铵 七叶苷 氯化锂 琼脂 犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售蒸馏水 吖啶黄素 头孢双硫唑甲氧 放线菌酮 硫酸盐粘功菌素 磷霉素 犃 制法除吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、磷霉素、硫酸盐粘菌素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调 至 ，再加入琼脂，灭菌 ，冷却至 ，无菌操作，加入用 乙醇和 无菌水溶解的吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、磷霉素，摇匀，倾注平板。犃 犘 犃 犔 犆 犃犕 琼脂犃 成分蛋白胨 淀粉 酵母浸膏 氯化钠 葡萄糖 甘露醇 柠檬酸铁铵 七叶苷 氯化锂 酚红 琼脂 蒸馏水 盐酸吖啶黄素 硫酸多粘菌素 复达新 犃 制法除盐酸吖啶黄素、硫酸多粘菌素、复达新和琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调 至 ，再加入琼脂，灭菌 ，冷却至，无菌操作，加入用适量无菌水溶解的盐酸吖啶黄素、硫酸菌素、复达新，摇匀，倾注平板。犃 磷酸盐缓冲溶液（犘 犅 犛）犃 成分氯化钠磷酸二氢钾 磷酸氢二钾 氧化钾 水 犃 制法将各成分溶解于蒸馏水中，用 氢氧化钠调至 。高压灭菌 ，用蒸馏水加至 贮存冰箱。犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售附录犅（规范性附录）单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图 犅 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图犛 犖犜 版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第部分：免疫磁珠法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷印数 书号：定价 元版权所有 禁止翻制、电子传阅、发售