SNT 0177-2011 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌计数方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌计数方法犕 犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉 犲 狀 狌 犿 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犮 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌 犿狆 犲 狉 犳 狉 犻 狀 犵 犲 狀 狊犻 狀犳 狅 狅 犱犳 狅 狉犲 狓 狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法。本标准与 相比，主要技术变化如下：变更为推荐性标准；检测方法部分参考了 ：食品和动物饲料微生物产气荚膜梭状芽孢杆菌计数菌落计数技术 内容，在标准中增加乳糖亚硫酸盐试验作为确证试验，减除了含卵黄的 琼脂和 培养基的使用；补充了商品化的全自动微生物鉴定仪。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、谢小珏、王赢、陈立。犛 犖犜 出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌计数方法范围本标准规定了出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌（犆 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌 犿狆 犲 狉 犳 狉 犻 狀 犵 犲 狀 狊）的计数检验方法。本标准适用于出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法 培养基制备指南第部分：实验室培养基制备质量保证通则 培养基制备指南第部分：培养基性能测试实用指南术语和定义下列术语和定义适用于本文件。产气荚膜梭状芽孢杆菌 犮 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌 犿狆 犲 狉 犳 狉 犻 狀 犵 犲 狀 狊在特定的选择性培养基上，细菌菌落生长呈现黑色特点（亚硫酸盐降解为硫化物而形成黑色沉淀物，并使菌落呈现黑色），分解乳糖产酸产气，内能液化明胶的细菌。设备和材料 无菌吸管：和 ，分刻度分别为 和 。无菌培养皿：直径。均质器及均质袋（或均质杯）。恒温培养箱或厌氧培养箱：。恒温水浴锅：。厌氧发生装置。放大镜和（或）菌落计数器。光学显微镜 。冰箱：。天平：感量。全自动微生物鉴定系统 ）。）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。犛 犖犜 培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为 规定的分析实验室用水。亚硫酸盐 环丝氨酸琼脂（）：见 。液体硫乙醇酸盐培养基：见。乳糖亚硫酸盐培养基（）：见 。缓冲动力硝酸盐培养基：见。亚硝酸盐检测试剂：见 。锌粉。乳糖明胶培养基：见。蛋白胨水：见。生化鉴定卡）。检验程序产气荚膜梭状芽孢杆菌检验程序见图。图产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验程序）由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。犛 犖犜 操作步骤 样品的稀释 无菌操作称取检样（）放入无菌均质器或均质袋中，加入 蛋白胨水，均质，制成 样品匀液。吸取 样品匀液，加入到蛋白胨水中，混合均匀，制成 样品匀液。必要时，按此法将样品作进一步的 倍递增稀释。接种与培养 选择个个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度分别吸取 样品匀液加入到两个无菌平皿内。将 维持在 的 琼脂倾注平皿，转动平皿使其混合均匀。待培养基凝固后，再覆盖上 琼脂，待其完全凝固。翻转平板，放入厌氧罐或其他适宜容器中，厌氧环境下 下培养。培养时间过长可能会导致平板颜色过黑。平板计数 选取菌落数 的平板，计数每个平板上的黑色菌落数，记录稀释倍数。每个平板挑取个典型或可疑菌落（小于个时应全部挑选）进行确证。乳糖亚硫酸盐试验确证 接种将 琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧环境下 下培养 。以无菌吸管移取硫乙醇酸盐培养物滴加入到乳糖亚硫酸盐（）培养基中。水浴中需氧条件下培养 。观察观察倒管内有否气泡产生及试管底部是否变黑（亚硫酸铁沉淀），若倒管中四分之一以上充满气体并且有黑色沉淀物则可判定为阳性。当倒管中产生的气体不足四分之一时，立即以无菌吸管从先前的 培养基中吸取滴加到另一 培养基试管中，水浴培养 ，再次观察结果。判读在 培养基中形成黑色菌落，同时 培养基中反应阳性的细菌，可确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌，除此之外应视为阴性。动力硝酸盐试验和乳糖明胶液化试验确证 纯化将 琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧条件下 培养 ，划线接种 琼脂平板，再覆盖上 琼脂。待其完全凝固后，厌氧条件下 培养 ，获得纯培养菌落。如有必要，可重复上述步骤，以获得完全分离的，典型的黑色菌落。犛 犖犜 接种将挑取的纯菌落分别穿刺接种缓冲动力 硝酸盐培养基和乳糖 明胶培养基，厌氧条件下 培养。动力硝酸盐试验观察在透射光下检查缓冲动力 硝酸盐培养基试管中细菌沿穿刺线生长情况，有动力的菌株沿着穿刺线呈扩散生长；没有动力的菌株，仅沿穿刺线生长。分别加 试剂甲与 试剂乙于缓冲动力硝酸盐培养基中以检查亚硝酸盐的存在。出现橙红色者，表明有菌株将硝酸盐还原成了亚硝酸盐。若 内未出现颜色变化，则添加少许金属锌粉，放置 。如果加锌粉后出现橙红色，表明菌株不能还原硝酸盐。若出现微弱的亚硝酸盐反应（如：浅粉色）则应排除，因为产气荚膜梭状芽孢杆菌的反应比较剧烈而且迅猛。乳糖明胶试验观察发现产气和培养基变黄色，表明乳糖发酵并产酸。将试管置冷却，检查明胶液化情况。若培养基仍为固态，则需 再培养，再次检查明胶是否液化。判读在 琼脂上形成黑色菌落，无动力的，通常会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，分解乳糖产酸产气，内能液化明胶的细菌，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。自动微生物鉴定系统确证如选择 ，可从 平板上挑选可疑菌落，用生理盐水制成浊度适当的菌悬液，使用 全自动微生物鉴定系统进行鉴定。判定任何符合 或者 的判读确证或者经 的鉴定为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。结果报告样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数，基于被证实为产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落的百分数。例如：稀释的平板中，平均有 个菌落，由个平板上选取的 个菌落中，有个被证实为产气荚膜梭菌，那么每克食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数，即为（）。根据计算结果报告检样中产气荚膜梭状芽孢杆菌数（）。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂）犃 亚硫酸盐 环丝氨酸（犛 犆）琼脂犃 基础培养基胰蛋白 酵母膏 大豆胨 焦亚硫酸钠（）柠檬酸铁铵 琼脂 犃 犇 环丝氨酸溶液溶解 环丝氨酸于 水中，过滤除菌。存放于，周内用完。犃 制备将基础培养基各成分加热溶解在 水中，调节 使灭菌后室温下 ，分装到适宜容量的烧瓶中，高压灭菌 。倒平皿前，将 基础培养基冷却到 ，加过滤除菌的 环丝氨酸溶液。当 琼脂培养基平板被用来作纯化菌落时（动力硝酸盐试验和乳糖明胶试验）时，可直接取 冷却到 的基础培养基倾注平板。存放于，可保存星期。犃 硫乙醇酸盐液体培养基胰酪胨 胱氨酸 葡萄糖 酵母膏 氯化钠 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸）刃天青 琼脂 将各成分加热溶解在 水中，调节 使灭菌后室温下 ，将培养基分装适宜的试管内，每管 ，高压灭菌 。在使用前，此培养基中应加热煮沸 减氧。）为保证培养基的质量，应按 、的规定进行培养基的制备与性能测试。犛 犖犜 犃 乳糖亚硫酸盐培养基（犔 犛）犃 基础培养基胰酪胨 酵母膏 氯化钠 乳糖 半胱氨酸盐酸盐 犃 焦亚硫酸钠溶液将 无水焦亚硫酸钠（）溶解在 水中，过滤除菌，当天使用。犃 柠檬酸铁铵溶液将 柠檬酸铁铵溶解在 水中，过滤除菌，当天使用。犃 制备将基础培养基各成分溶解在 水中（如有必要可加热），调节 使灭菌后室温下 ，分装至装有倒置小导管的试管中，每管，高压灭菌 。若非配制当天使用，则在临甩前需加热煮沸 减氧。存放于，周内用完。临用时每管添加 焦亚硫酸钠溶液和 柠檬酸铁铵溶液，当天使用。犃 缓冲动力硝酸盐培养基胰酪胨 牛肉膏 半乳糖 甘油 硝酸钾（）磷酸氢二钠（）琼脂 将各成分加热溶解在 水中，调节 使灭菌后室温下 ，分装到适宜的试管内，每管，高压灭菌 。若非配制当天使用，存放于。临用前，沸水浴或者蒸汽加热 ，迅速冷却至培养温度。配制后周内用完。犃 亚硝酸盐试剂犃 试剂甲在 乙酸中溶解对氨基苯磺酸；通过滤纸过滤；存放在密封性良好的有塞棕色瓶（最好备有滴头），温度保持在。犃 试剂乙在 乙酸中溶解 苯酚。通过滤纸过滤；存放在密封性良好的有塞棕色瓶（最犛 犖犜 好备有滴头），温度保持在。犃 乳糖 明胶培养基胰酪胨 酵母膏 乳糖 磷酸氢二钠（）酚红 明胶 将各成分加热溶解在 水中，调节 使灭菌后室温下 ，加入乳糖和酚红。分装到适宜的试管内，每管 。高压灭菌 。若非配制当天使用，存放于。临用前，沸水浴或者蒸汽加热 ，迅速冷却培养温度。配制后周内用完。犃 蛋白胨水在 水中溶解蛋白胨，调节 使灭菌后室温下 。分装。高压灭菌 。犛 犖犜