GBT 8381.5-2005 饲料中北里霉素的测定.pdf

I C S 6 5.1 2 0B 4 6荡黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 8 3 8 1.5-2 0 0 5饲料中北里霉素的测定De t e r mi n a t i o n o f k i t a s a my c i n i n f e e d2 0 0 5-0 9-0 5 发布2 0 0 6-0 2-0 1 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB/T 8 3 8 1.5-2 0 0 5月 舌 本标准参考了国内外有关北里霉素生产、检验等资料，根据我国饲料工业的实际情况制定。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由辽宁省兽药饲料监察所负责起草，吉林省兽药监察所和国家饲料监督检验测试中心(北京)参加起草。本标准主要起草人:陈莹莹、曹东、董永亮、刘雪红、曲韵坤、战石、肖勇、李广生、刘同民、杨曙明。GB/T 8 3 81.5-2 0 0 5饲料中北里霉素的测定范 围本标准规定了饲料中北里霉素的测定方法。本标准适用于浓缩饲料、配合饲料中北里霉素的鉴别和含量测定。采用本方法鉴别北里霉素的最小含量为 2.5 mg/k g,采用本方法测定北里霉素定量的检测限为每千克饲料中含2 5 0 0 北里霉素效价单位。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 1 4 6 9 9.1 饲料采样 中华人民共和国兽药典(2 0 0。年版一部)3术语和定义下列 术语 和定义适用于本标准。北里尽素效价单位 用微生物法测定的北里霉素的生物活性单位，用 u 表示。北里霉素中所含的抗菌活性部分的质量与生物活性单位的关系为 1 mg 相当于1 0 0 0 北里霉素效价单位。4试荆和溶液 除非另有说明，在本分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水(或去离子水，或相当纯度的水)。4.1 北里霉素标准品，符合 中华人民共和国兽药典 2 0 0。年版一部的要求。4.2 藤黄微球菌(Mi c r o c o c c u s l u t e u s),C MC C 2 8 0 0 1.43 甲醇。4.4乙酸乙醋。4.5正己烷。4.6 硅胶 G，薄层层析用。4.7 盐酸溶液，取市售盐酸 2 3.4 m L用水稀释至 1 0 0 mL,4.8 氢氧化钠溶液，取氢氧化钠 4g，加水溶解并稀释到 1 0 0 mL.4.9 展开剂 1,氯仿一 甲醇,9 5+5 e4.1 0 展开剂 2，苯一 丙酮，4+3 04.1 1 1 0%硫酸乙醇溶液。4.1 2甲醇一 水，1+1,4.1 3 盐酸溶液,c(HC I)二1 mo t/L.4.1 4 北里霉素标准品溶液，称取5 0 mg 北里霉素标准品(4.1)，精确至。.1 mg，置 5 0 m L量瓶中，用甲醇(4.3)溶解并稀释成浓度约为 1 mg/mL的溶液。供薄层鉴别用。4.1 5 北里霉素标准品贮备液:称取 5 0 m g北里霉素标准品，精确至。.1 m g，置5 0 mL量瓶中，用甲醇 1GB/T 8 3 8 1.5-2 0 0 5溶解并稀释成浓度约为 1 0 0 0 u/mL的溶液。在 2 0C-1 0 可以保存 7 天。供含量测定用。5仪器及设备5.1 分析天平，感量 0.0 0 0 1 g,5.2 天平，感量 0.0 1 g.5.3 旋转蒸发器。5.4 浓缩瓶，容量 1 0 m L，底部具。.2 m L刻度尾管。5.5 玻璃板，规格 2 0 c mX1 0 c m,5.6 展开槽，立式，规格1 0 c mX 5 c m X2 0 c m,5.7 薄 层涂布器，涂布 厚度。.3 m m.5.8 微量注射器，2 5 p L,5 0 p Lo5.9 振荡器。5.1 0 离心机。5.1 1 电热恒温水浴。5.1 2 平底双碟:直径约 9 0 mm,高 1 6 m m-1 7 mm;符合 中华人民共和国兽药典 2 0 0 0年版一部的要求。5.1 3 不锈钢小管:高1 0.0 mm士0.1 m m，外径8.0 m m士0.1 mm，内径 6.0 mm士0.1 mm;符合(中华人民共和国兽药典 2 0 0。年版一部的要求。5.1 4 恒温培养箱。5.1 5 高压灭菌锅。5.1 6 游标卡尺(精度 0.0 2 mm)或抑菌圈测量仪。试样 的制备 将按 G B/T 1 4 6 9 9.1取得的样品，四分法缩分，取约2 0 0 g，经粉碎，全部过 1 m m孔筛，混匀，装人磨 口瓶中备用。鉴别7.1 原理 用 p H3的水溶液从试样的乙酸乙醋溶液中提取北里霉素，调节水溶液的p H值到8，再用乙酸乙醋萃取水溶液中的北里霉素，经浓缩、溶剂转换，与标准品同时在硅胶 G薄层板上展开，比较两种展开剂条件下二者的R 值，鉴别试样中是否含有北里霉素。7.2 测定步骤7.2.1 提取 取 2 0 g试样(6)，精确至 0.0 1 g，到 1 5 0 m L具锥形瓶中，加人 2 0 m L乙酸乙醋(4.4)，振摇3 0 m i n,过滤，滤渣及容器用 1 0 mL乙酸乙醋分四次冲洗，合并滤液于旋转蒸发器(5.3)的蒸发瓶中，在低于6 0 C减压蒸发至约余 2 mL.7.2.2 净化 将浓缩液(7.2.1)转移到 1 2 5 mL分液漏斗中，用3 mL乙酸乙醋分 2 次洗涤蒸发瓶，洗液并人分液漏斗(此时溶液体积以控制在约 5 mL为宜)。取事先用盐酸溶液(4.7)调节至 p H 3的水 5 mL到分液漏斗中，振摇 1 mi n，收集下层水提取液，反复提取 3次，合并水提取液。用 3 0 mL正己烷(4.5)分 3次洗涤水提取液，弃去正己烷。用l m o l/L 氢氧化钠溶液(4.8)调节水提取液至p H 8，再用3 0 m L乙酸乙醋分 3 次同上述酸性水提取方法提取，小心分出上层乙酸乙醋提取液于蒸发瓶中，在低于 6 0 0C减压蒸干。GB/T 8 3 81.5-2 0 0 57.2.3 试样溶液的制备 用 5 mL甲醇分3次溶解残渣(7.2.2)，将溶液转移到浓缩瓶(5.4)中，于6 0 水浴中蒸干，冷却至室温后加人。.1 mL甲醇溶解残渣留作薄层层析用。7.2.4测定7.2.4.1 薄层板的制备 取 4g 硅胶G(4.6)，加水约 1 1 m L，研磨 2 m i n至呈粘稠状，铺成三块薄层板(5.5),置室温干燥后，于 1 0 5 活化 2 h-3 h,贮干燥器中备用。2 4 h内使用。7.2.4.2 点样 取两块薄 层板(7.2.4.1)，在每块薄层板距下端2 c m处作为基线点样。每块板各点三个样点:1 0 f4 L 北里霉素标准品溶液(4.1 4),5 t4 L试样溶液(7.2.3)和 5 j.L北里霉素标准品溶液、1 0 k L试样溶液，放置3 0 m i n。各点间距离应不小于 2 c m,7.2.4.3展开 在两个展开槽内分别加人展开剂 1(4.9)和展开剂 2(4.1 0)各 1 0 mL，将点好样的两块薄层板分别置展开剂中纵展 1 3 c m，取出通风挥干。7.2.4.4 显 影 在展开后的薄层板上喷上一层均匀、湿度合适的1 0%硫酸乙醇溶液(4.1 1)，于通风处放置显色，也可以在 1 0 0 流通空气中加热，加速显色。7.3 观察与判定 比较薄层板上各斑点的位置以及颜色，判定方法如下:在两块薄层板上，试样溶液在与标准品溶液主斑点(面积最大的、颜色最深的斑点)对应处均无 斑点出现，且混合加样点的斑点颜色比标准品溶液斑点浅，判定试样中北里霉素阴性;两块薄层板中，其中一块板上的试样溶液在与标准品溶液斑点对应处无斑点出现，而另一块板 出现斑点，判定试样中北里霉素阴性;在两块薄层板上，如果试样溶液在与标准品溶液斑点对应处均出现斑点，混合加样点只显现一 个斑点且斑点的位置及颜色与标准品溶液斑点相同，可能判定北里霉素阳性，继续以下含量 测定。8含f测定8.1原理 在酸性加热条件下，试样中的北里霉素被钝化，失去生物活性，用该钝化液稀释标准品溶液，使与未经钝化的试样溶液处相同背景，以抵消杂质的干扰，用微生物标准曲线法测定含量8.2 测定步骤日.2.1 蔺盈液的制备 取藤黄微球菌(4.2)的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基(第 A.4 章)的培养瓶中，在2 6 0C 解 7 培养2 4 h，或采用适当 方法制备的菌斜面。用。.9%灭菌氯化钠溶液(第A.1 章)将菌苔洗下，置 4 冰箱保存(不宜超过两周)。8.2.2 双碟的制备 取平板培养基(第 A.5章)加热融化，冷却至 5 0 士1 C，加人适量菌悬液(8.2.1)(以参考浓度标准工作液所至抑菌圈直径在 1 5 mm士1.5 m m为宜)，必要时，每 1 0 0 mL培养基中可加人 5 0 0 0 葡萄糖溶液(第A.3 章)2 m L，摇匀。每个双 碟(5.1 2)加人7 m L，均匀摊布，放置水平台上冷却，待培养基凝固后，将双碟倒置于 4 0C，冷藏 1h以上。临用前取出，在每个双碟内半径为 2.8 c m 圆周上等距离放置6 个不锈钢小管(5.1 3)GB/T 8 3 81.5-2 0 0 58.2.3 钝化液的制备 量取制备试样溶液(8.2.5)的上清液 2 0 m L到 5 0 0 m工具塞锥形瓶中，加 1 mo l/L盐酸溶液(4.1 3)1 m L，摇匀，密塞，在 1 0 0 水浴中加热 1h，冷却至室温后，用 1 m o l/L氢氧化钠溶液调节 p H至 7.8-8.0，加 5 mL甲醇，用氯化钠磷酸盐缓冲液(第A.2 章)稀释到与试样溶液相同的浓度。8.2.4 标准曲线的制备8.2.4.1 标准工作溶液 量取北里霉素标准贮备液(4.1 5)，用钝化液(8.2.3)稀释使成。.0 5 u/m L,O.1 0 u/m L,O.2 0 u/m L,0.4 0 u/m L 浓度的 标准工作溶液。以。1 0 u/m L 为参考浓度标准工作溶液。日2.4.2 培养 取当天制备好的双碟(8.2.2)平均分为4组，标准工作溶液(8.2.4.1)每一浓度为一组。每一个双碟的6 个不锈钢小管中，间位的 3 个滴加参考浓度标准工作溶液，另外 3 个滴加该组标准工作溶液，每组滴加至少 3个双碟，于3 6 0C-3 7 培养 1 6 h-1 8 h,8.2.4.3 标准曲线 测量各组参考浓度标准工作溶液和该组标准工作溶液抑菌圈数值，分别计算平均值，再计算所有双碟参考浓度标准工作溶液抑菌圈的总均值，作为修正值。各浓度组的抑菌圈数值按式(1)修正:A,=B。一 B+A (1)式 中:A。该浓度标准工作溶液被修正后的抑菌圈数值;B,修正值;B 该浓度组中参考浓度标准工作溶液所至抑菌圈读数平均值;A 该浓度标准工作溶液抑菌圈读数平均值。以各组溶液浓度的对数与该组溶液被修正后的抑菌圈数值作线性回归，求出回归方程。相关系数r 应不小于0.9 9 08.2.5 试样溶液的制备 取试样 2 5 g，精确至。.0 1 g，于 1 5 0 mL具塞锥形瓶 中，准确加人 5 0 m L甲醇一 水(4.1 2)，振摇3 0 mi n，转移至离心管中，3 0 0 0 r/mi n 离心 5 mi n，用氯化钠磷酸盐缓冲液准确稀释至适当浓度(使溶液中北里霉素的浓度在 0.0 5 u/mL -0.4 0 u/mL之间)制成试样溶液。当天使用。保留剩余上清液，用于制备钝化液。8.2.6 测定 取与标准曲线同时制备的至少 3个双碟，按标准曲线的制备方法(8.2.4)分别滴加试样溶液(8.2.5)和参考浓度标准工作溶液，与标准曲线同时操作和培养。判定与结果计算9.1 判定 试样溶液不产生抑菌圈，判定北里霉素阴性;试样溶液产生抑菌圈，判