GBT 5009.22-1996 食品中黄曲霉毒素B1的测定方法.pdf

中华 人 民共 和 国 国家 标 准G B/T 5 0 0 9.2 2-1 9 9 6食品中黄曲霉毒素B i 的测定方法代替 G T i 5 0 0 9.2 2 8 5Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f a f l a t o x i n B 1 i n f o o d s1 主题内容与适用范围 本标准规定了粮食、定方法 本标准适用于粮食、定花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中黄曲霉毒素B,的测花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中 黄曲霉毒素B，的测 本 标准 分为两法。在第一法中，薄层 板上黄曲 霉毒素B，的 最低检出 量为。.0 0 0 4 K g，最低 检出 浓度为5 F l g/k g。第二法对黄曲霉毒素B，的最低检出浓度为。o f tA g/k g,第一篇第一法2 原理 样品中 黄曲霉毒素B,经提取、浓缩、薄层分离后，在波长3 6 5 n m紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。3 试剂3i3.23.33.43.53.63.7;:不氯甲 烷。正己 烷或石油醚(沸程3 0-6 0 C 或6 0-9 0 C).甲醇苯 乙月 青。无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水。丙酮以上试剂在试验时先进行一次试剂空白 试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。硅胶G:薄层色谱用。二 三 氟乙酸。无水硫酸钠。氯化钠。苯一 乙 睛混合液:量取9 8 m L苯，加2 m L乙 睛，混匀。甲醇水溶液:5 5，4 5,黄曲霉毒素B,标准溶液。1 仪器校正:测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出 使用仪器的校正因素。准确称取2 5 m g娜3113.123.133.14314经干 燥的重铬酸钾(纂准级)，用硫酸(。5+1 0 0 0溶解后并准确稀释至2 0 0 m L，相当于:(K 形r 刀7)=中华人民共和国卫生部，9 9 6 一 0 6 一 1 9 批准1 9 9 6 一 0 9 一 的 实施G B/T 5 0 0 9.2 2-1 9 9 6。0 0 0 4 m a t/L。再吸取2 5 m L此稀释液于5 0 m L 容量瓶中，加硫酸(0.5+1 0 0 0)稀释至刻度，相当于0.0 0 0 2 m o l/L溶液。再吸取2 5 m L 此稀释液于5 0 m L容量瓶中，加硫酸(0.5+1 0 0 0)稀释至刻度.相当于。0 0 0 1 m o l 儿 溶液。用 1 c m石英杯，在最大吸收峰的波长(接近 3 5 0 n 二处)用硫酸(0.5 1-1 0 0 0)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度，并按式(1)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。，”“.(1)乃。式中:E,重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，测得重铬酸钾溶液的吸光度;重铬酸钾溶液的摩尔浓度。再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3 f=1 6 0比较3 1 6 0 E，即求出 使用仪器的校正因素。.“.哈”臼“.”(2)式中:了 使用 仪器的校 正因 素，E 测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。若f 大于。.9 5 或小于1.0 5，则使用仪器的校正因素可略而不计。3.1 4.2 黄曲 霉毒素B,标准溶液的 制备:准确称取1-1.2 m g 黄曲 橄毒素B、标准品，先加人2 m L乙睛溶解后，再用苯稀释至1 0 0 m L,避光，置于4 冰箱保存.该标准溶液约为1 0 ta g/m L。用紫外分光光度计测此标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。3.1 4.2.1 计算 v AXM x1 0 0 0 xf X,=立 二 -二 二 几 乙 止 二 二:二 二 二-么.(3)E,式中:X,黄曲 霉 毒 素B，标 准 溶 液 的 浓 度,li g/m L;A 测得的吸光度值;了 使用仪器的校正因素;M 黄曲 霉毒素B，的分子量3 1 2;E 2 黄曲霉毒素B,在苯一 乙 腊混合液中的摩尔消光系数,1 9 8 0 0,根据计算，用笨一 乙睛混合 液调到标准溶液浓度恰为1 0.0 l e g/m L，并用分光光度计核对其浓度.3.1 4.3 纯度的 测定:取5 W L 1 0 l e g/m L黄曲霉毒素B,标准溶液，滴加于涂层厚度。2 5 m m的硅胶G薄层板上，用甲醇一 三氯甲 烷(4 十9 6)与丙酮一 三氯甲 烷($-1-9 2)展开剂展开，在紫外光灯下观察荧光的产生，必须符合以下条件:3.1 4.3.13.1 4-3.2在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质荧光点。原点上没有任何残留的荧光物质。3.巧 黄曲霉毒素B，标准使用液:准确吸取1 m L标准溶液(1 0 ji g/m L)于1 0 m L容量瓶中，加苯一 乙 膀混合液至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于1.0 l e g 黄曲霉毒素B,.吸 取1.0 m L此稀释液，置于5 m L 容量瓶中，加苯一 乙 睛混合 液稀释至刻度，此溶液每毫升相当于0.2 l e g 黄曲霉毒素B,。再吸取黄曲霉毒素B，标准 溶液(0.2 p g/m L)1.0 m L 置于5 m L 容量瓶中，加苯 一 乙 腑混合 液稀释至 刻度。此溶液 每毫升相当于。.0 4 p g 黄曲 霉毒素B3.1 6 次氯酸钠溶液(消毒用):取1 0 0 g 漂白 粉，加入5 0 0 m L水，搅拌均匀。另将$0 g 工业用碳酸钠(N a,C O,-I O H Z O)溶于5 0 0 m L温水中，再将两液混合、搅拌，澄清后过滤。此滤液含次氯酸浓度约为2 5 g/1。若用漂粉精制备，则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为5 0 g/L。污染的玻璃仪器用1 0 g/1 次氛酸钠溶液浸泡半 天或用5 0 g/L次氛酸钠溶液浸泡片刻后，即可达到去毒效果。4 仪器4.1 小型粉碎机。G B/T 5 0 0 9.2 2-1 9 9 64.2 样筛。4.3 电动振荡器。4.4 全玻璃浓缩器。4.5 玻璃板:5 c m X 2 0 c m,4.6 薄层板涂布器。4.7 展开槽:内长2 5 c m、宽6 c m、高4 c m,4.8 紫外光灯:1 0 0 1 2 5 w，带有波长3 6 5 n m滤光片。4.9 微量注射器或血色素吸管，5 分析步骤5.，取样 样品中污染黄曲 霉毒素高的霉粒一粒可以左右测定结果，而且有毒霉粒的比例小，同时分布不均匀。为 避免取样带来的误差，必须大量取样，并将该大量样品粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果，因此采样必须注意以下几点。5.1.1 根据规定采取有代表性样品。5.1，2 对局部发霉变质的样品枪验时，应单独取样。5.1.3 每份分析测定用的样品应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至。.5-1 k g，然后全部粉碎。粮食样品全部通过2 0目 筛，混匀。花生样品全部通过1 0目 筛，混匀。或将好、坏分别测定，再计算其含量。花生油和花生酱等样品不需制备，但取样时应搅拌均匀。必要时，每批样品可采取3 份大样作样品制备及分析测定用，以观察所采样品是否具有一定的代表性。5.2 提取5.2.1 玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。5.2.1.1 甲 法:称取2 0.0 0 g 粉碎过筛样品(面粉、花生酱不需粉碎)，置于2 5 0 m L具塞锥形瓶中，加3 0 m L正己 烷或石油醚和1 0 0 m L甲 醉水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡3 0 m i n，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲 醉水溶液分清后，放出甲醉水溶液于另一具塞锥形瓶内。取2 0.0 0 m L甲 醉水溶液(相当于4 g 样品)置于另一1 2 5 m L 分液漏斗中，加2 0 m L三氯甲 烧，振摇2 m in，静置 分层，如出 现乳化现象可 滴加甲 醉促使分层。放出 三抓甲 烷层，经盛有约1 0 g预先用三氯甲 烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于5 0 m L 燕发皿中，再加5 m L 三氯甲 烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三抓甲烷层一井滤于蒸发皿中，最后用少量三抓甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜，于“水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2 -3 m i n 后，准确加入1 m L 苯一 乙睛混合液(或将三抓甲烷用浓缩燕馏器减压吹气蒸干后，准确加入1 m L苯一 乙睛混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充 分混合，若有苯的结晶析出，将燕发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2 m L具塞试管中。5.2.1.2 乙 法(限于玉米、大米、小麦及其制品):称取2 0.0 0 g 粉碎过啼样品于2 5 0 m L具塞锥形瓶中，用滴管滴加约6 m L水，使样品湿润，准确加入6 0 m L三抓甲 烷，振荡3 0 m i n，加1 2 g 无水硫酸钠，振摇后，静置3 0 m i n，用亚成折盈式的快速定性滤纸过滤于1 0 0 m L 具塞锥形瓶中。取1 2 m L滤液(相当4 g样品)于蒸发皿中，在6 5 水浴上通风挥千，准确加人1 m L苯一 乙睛混合液，以下按5.2.1.1自“用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合”起，依法操作。5.2.2 花生油、香油、菜油等:称取4.0 0 g 样品置于小烧杯中，用2 0 m L正己 烷或石油醚将样品移于1 2 5 m L 分液漏斗中。用2 0 m L甲 醇 水溶液分次洗烧杯，洗 液一并移入分液漏斗中，振摇2 m i n，静置分层后，将下层甲醉水溶液移人第二个分液漏斗中，再用5 m L甲 醉水溶液重复振摇提取一次，提取液一井移入第二个分液漏斗中，在第二个 分液漏斗中加入2 0 m L 三氛甲 烷，以下按5.2.1.1 自“振摇2 m i nii$W分层，起，依法操作。G e/T 5 0 0 9.2 2-1 9 9 65.2.3 酱油、醋:称取1 0.0 0 g 样品于小烧杯中，为防止提取时乳化，加。4 g 氯化钠，移入分液漏斗中，用1 5 m L三氯甲烷分次洗涤烧杯 洗液并入分液漏斗中。以下按 5.2.1.1自“振摇 2 m i n,静段分层”起，依法操作，最后加人25 m L 苯一 乙睛混合液，此溶液每毫升相当于4 9 样品。或称取1 0.0 0 g 样品，置于分液漏斗中，再加1 2 m L甲醉(以酱油体积代替水，故甲 醇与水的体积比仍约为5 5 一 1-4 5)，用2 0 m l 三氯甲 烷提取，以下按5.2.1.1 自“振摇2 m i n,静置分层”起，依法操作。最后加入2.5 m l苯一 乙 睛混合液。此溶液每毫升相当 于4 9 样品。5.2.4 干酱类(包括豆豉、腐乳制品):称取2 0.0 0 g 研磨均匀的样品，置于2 5 0 m L具塞锥形瓶中，加入2 0 m L正己 烷或石油醚与5 0 m L甲醉水溶液。振荡3 0 m i n,静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取2 4 m L甲醇水层(相当8 g 样品，其中 包括8 g 干酱类本身约含有4 m L水的体积在内)置于分液漏斗中，加人2 0 m l三氯甲 烷，以下按5.2.1工 自“振摇2 m i n，静咒分层”起，依法操作。最后加 人2 m L 苯一 乙睛混合液。此溶液每毫升相当于4 9 样品525 发酵酒类:同5.2.3 处理方法，但不加氯化钠。53 测定5.3.1 单向展开法5.3.1.1 薄层板的制备:称取约3 g 硅胶G，加相当于硅胶量2 -3 倍左右的水，用力研磨 1-2 m i n 至成糊状后立即倒于涂布器内，推成 5 c m X 2 0 c。甲 厚度约 0.2 5 m m的薄层板三块。在空气中干燥约1 5 m i n 后，在l o o c 活化2 h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2-3 d,若放置时间较长，可再活化后使用。5.3.1.2 点样:将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3 c。的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4 个点，点距边缘和