GBT 5009.27-1996 食品中苯并(a)芘的测定方法.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G s/T 5 0 0 9.2 7-1 9 9 6食品中苯并(a)花的测定方法代替 G B 5 0 0 9.2 7-8 5Me t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f b e n z o(a)p y r e n e i n f o o d s1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中苯并(a)花的测定方法。本标准适用于食品中苯并(a)花的测定。样品量为5 0 g，点样量为1 g 时，方法最低检出浓度为1 n g/g,2 原理 样品先用有机溶剂提取，或经皂化后提取，再将提取液经液一 液分配或色谱柱净化，然后在乙酞化滤纸上分离苯并(a)花，因苯并(。)花在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点，将分离后有苯并(a)花的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后，用荧光分光光度计测荧光强度与标准比较定量。3 试剂3.1 苯:重蒸馏3.2 环己烷(或石油醚，沸程3 0-6 0 C):重蒸馏或经氧化铝柱处理无荧光。3.3 二甲基甲酞胺或二甲基亚Mo3.4 无水乙醇:重蒸馏。3.5 乙醇(9 5%)03.6 氢氧化钾。3了 丙酮:重蒸馏。3.8 石油醚(6 0 9 0 0c):重蒸。3.9 甲 酸(8 80-9 0%),3 门0 无水硫酸钠:1 2 0 0C 烤 2 h以上。3.1 1 咖啡因甲 酸溶液(1 5 0 g/L):称咖啡因(医用或试剂用)1 5 g,溶于适量甲 酸中，再稀释至1 0 0 m L,3.1 2 甲 酸(4 0%),3.1 3 硫酸钠溶液(2 0 g/L),3.1 4 脱脂棉:用二抓甲烷回流4 h以上。3.1 5 展开剂:乙醇(9 5%)一 二抓甲 烷(2:1),3.1 6 硅镁型吸附 剂:将6 0-1 0 0 目 筛孔的硅镁吸附剂经水洗四 次(每次用水量为吸附剂质量的4 倍)于垂融漏斗上抽滤干后，再以 等量的甲 醉洗(甲 醇与吸附 剂量克数相等)，抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在1 3 0 干燥5 h 后，装瓶贮存于干燥器内，临用前每1 0 0 g 加5 g 水减活，混匀并平衡4 h 以上，最好放置过夜。3.1 7 层析用氧化铝(中性):1 2 0 活化4 h,3.1 8 乙酸化滤纸:将中速层析用滤纸裁成3 0 c m X 4 c m的条状，逐条放入盛有乙酞化混合液(1 8 0 m L中华人民共和国卫生部1 9 9 6 一 0 6 一 1 9 批准1 9 9 6 一 0 9 一 0 1 实施G B/T 5 0 0 9.2 7-1 9 9 6苯、1 3 0 m 工 _ 乙酸配、。1 m L硫酸)的5 0 0 m 工 J 烧杯中，使滤纸充分地接触溶液，保持溶液温度在2 1 以上，时时搅拌，反应6 h，再放置过夜。取出滤纸条，在通风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡4 h，取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温内风干压平备用，一次可处理滤纸 1 5 -1 8 条。3.1 9 笨并(a)花标准溶液:精密称取 1 0.0 m g 苯并(a)t，用苯溶解后移入1 0 0 m L棕色容量瓶中，并稀释至刻度，此溶液每毫升相当于苯并(a)花1 0 0 u g。放置冰箱中保存。3.2 0 苯并 a)r,标准使用液:吸取 1.0 0 m l-苯并(a)t t 标准溶液置于 1 0 m L容量瓶中，用苯稀释至刻度，同法依次用苯稀释，最后配成每毫升相当于 1.。及。.1 F i g 苯并(a)花两种标准使用液，放置冰箱中保存。4 仪器4.1 脂肪提取器。4.2 层析柱:1 0 -1 5 m m，长3 5 0 m m，上端有内径2 5 m m，长8 0 -1 0 0 m m内径漏斗，下端具有活塞。4.3 层析缸(筒)。4.4 K-D全玻璃浓缩器。4.5 紫外光灯:带有波长为3 6 5 n m或2 5 4 n m的滤光片。4.6 回流皂化装置:锥形瓶磨口 处连接冷凝管。4.7 组织捣碎机。4.8 振荡器:装有自 制木架，每次可摇 6 个分液漏斗。4.9 微量注射器:2 5 p L,5 0 u L4.1 0 荧光分光光度计。5 分析步骤5.1 荧光分光光度法5.1.1 样品提取5.1.1.1 粮食或水分少的食品:称取 4 0.0 -6 0.0 g 粉碎过筛的样品，装人滤纸筒内，用 7 0 m L环己烷润湿样品，接收瓶内装6-8 g 氢氧化钾、1 0 0 m L乙醇(9 5%)及6 0 8 0 m L环己 烷，然后将脂肪提取器接好，于9 0 水浴上回流提取6-8 h，将皂化液趁热倒人 5 0 0 m L分液漏斗中，并将滤纸筒中的环己 烷也从支管中 倒入分液漏斗，用5 0 m I乙 醇(9 5%)分二次洗接收瓶，将洗液合并于分液漏斗。加人1 0 0 m l-水，振摇提取3 m i n，静置分层(约需2 0 m i n)，下层液放入第二分液漏斗，再用7 0 m L环己 烷振摇提取一次，待分层后弃去下层液，将环己 烷层合并于第一分液漏斗中，并用 6 -8 m L环己烷淋洗第二分液漏斗，洗液合并。用水洗涤合并后的环己 烷提取液三次，每次1 0 0 m L，三次水洗液合并于原来的第二分液漏斗中，用环己 烷提取二次，每次3 0 m L，振摇。.5 m i n，分层后弃去水层液，收集环己 烷液并入第一分液漏斗中，于5 0 -6 0 水浴上，减压浓缩至4 0 m L，加适量无水硫酸钠脱水。5.1.1.2 油脂5.1.1.2.1 植物油:称取2 0.0-2 5.0 g 的混匀油样，用1 0 0 m L环己 烷分次洗入2 5 0 m L 分液漏斗中，以环己烷饱和过的二甲基甲酞胺提取三次，每次4 0 Va L，振摇 1 m i n.合并二甲基甲酞胺提取液，用4 0 m L 经二甲 基甲 酞胺饱和过的环己 烷提取一次，弃去环己 烷液层。二甲 基甲 酞胺提取液合并于预先装有2 4 0 m L 硫酸钠溶液(2 0 g/L)的5 0 0 m L 分液漏斗中，混匀，静置数分钟后，用环己 烷提取二次，每次1 0 0 m l，振摇3 m i n，环己 烷提取液合并于第一个5 0 0 m L 分液漏斗。也可用二甲 基亚矾代替二甲 基甲 酞胺。用4 0 -5 0 0C 温水洗涤环己 烷提取液二次，每次1 0 0 m L，振摇0.5 m i n，分层后弃去水层液，收集环己 烷层，于5 0.6 0 水浴上减压浓缩至4 0 m L。加适量无水硫酸钠脱水。5.1.1.2.2 甲酸一 咖啡因净化提取法(适用于油脂)G B/T 5 0 0 9.2 7-1 9 9 6 称取混匀油样1 0.0 0 g，用9 0 m L 石油醚分数次转人1 0 0 m l 分液漏斗中，用甲 酸提取三次，每次1 0 m L，于振荡器上振摇2 m i n，静置分层，弃去下层甲 酸。石油醚层以咖啡因一 甲酸溶液(1 5 0 g/1.)萃取三次，每次1 0 m l-，振摇3 m i n，静置分层，待彻底澄清后，仔细将咖啡因提取液(注意切勿带入醚层或乳化层)转入 3 0 0 m L具塞锥形瓶中，加1 2 0 m L硫酸钠溶液(2 0 g/1.)稀释，加5 0 m l石油醚猛烈振摇4 m i n，转入 2 5 0 m L分液漏斗中，静置分层，下层再转入原锥形瓶中，加5 0 m L石油醚重提一次，合并两次石油醚提取液，加2 0 m L甲酸(4 0 0 0),摇 1 m i n，弃去甲 酸水溶液(除去残留的咖啡因)，将石油醚提取液通过无水硫酸钠(约3 5 g)的漏斗，脱水，转入K-D浓缩器中，减压浓缩至近干，以少量环己 烷冲洗导管，混匀，吹氮(或室温挥发)定容至0.2 m L，密塞、避光、冷藏保存，备用。本法无需再过柱净化，以下按5.1.3 操作。5.1.1.3 鱼、肉 及其制品:称取5 0.0 -6 0.0 g 切碎混匀的样品，再用无水硫酸钠搅拌(样品与无水硫酸钠的比例为1:1 或 1:2，如水分过多则需在6 0 C 左右先将样品烘干)，装入滤纸筒内，然后将脂肪提取器接好，加入 1 0 0 m L环己 烷于 9 0 C 水浴上回流提取6 8 h，然后将提取液倒入 2 5 0 m L分液漏斗中，再用6 -8 m 工环己烷淋洗滤纸筒，洗液合并于2 5 0 m L分液漏斗中，以下按 5.1.1.2自“以环己 烷饱和过的二甲基甲酞胺提取三次”起依法操作。5.1.1.4 蔬菜:称取1 0 0.0 g 洗净、晾干的可食部分的蔬菜，切碎放入组织捣碎机内，加1 5 0 m L丙酮，捣碎2 m i n。在小漏斗上加少许脱脂棉过滤，滤液移入5 0 0 m l分液漏斗中，残渣用5 0 m L丙酮分数次洗涤，洗液与滤液合并，加1 0 0 m L 水和1 0 0 m L环己 烷，振摇提取2 m i n，静置分层，环己 烷层转入另一5 0 0 m L 分液漏斗中，水层再用1 0 0 m L 环己 烷分二次提取，环己 烷提取液合并于第一个分液漏斗中，再用2 5 0 m L水，分二次振摇、洗涤，收集环己 烷于5 0-6 0 水浴上减压浓缩至2 5 m L，加适量无水硫酸钠脱水5 门.1.5 饮料(如含二氧化碳先在温水浴上加温除去):吸取5 0.0 -1 0 0.0 m L样品于5 0 0 m L分液漏牛 中，加2 g 氯化钠溶解，加5 0 m L环己烷振摇 1 m i n，静置分层，水层分于第二个分液漏斗中，再用5 0 m l,环己烷提取一次，合并环己烷提取液，每次用 1 0 0 m L水振摇、洗涤二次，收集环己烷于5 0-6 0 C水浴上减压浓缩至2 5 m L，加适量无水硫酸钠脱水。5 门.1.6 糕点类:称取5 0.0 -6 0.0 g 磨碎样品，装于滤纸筒内，以下按5.1.1.1自“用7 0 m l.环己 烷湿润样品”起依法操作。在5.1.1.1,5.1.1.3 -5.1.1.6 各项操作中，均可用石油醚代替环己 烷，但需将石油醚提取液蒸发至近干，残渣用2 5 mL环己烷溶解。5.1.2 净化5 门.2.1 于层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入5-6 c m的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入5 -6 c m的硅镁型吸附剂，上面再装入 5 -6 c m无水硫酸钠，用3 0 m L环己烷淋洗装好的层析柱，待环己烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭活塞。5.1.2.2 将样品环己 烷提取液倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为每分钟1 m L，必要时可用适当方法加压，待环己 烷液面下降至无水硫酸钠层时，用3 0 m L苯洗脱，此时应在紫外光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如3 0 m L苯不足时，可适当增加苯量。收集苯液于5 0-6 0 水浴上减压浓缩至0.1-0.5 m L 可根据样品中苯并(a)花含量而定，应注意不可蒸干。5.1.3 分离5.1.3.1 在乙酸化滤纸条上的一端5 c m处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点2 0 K L苯并(a)花的标准使用液(1,g/m l,)，点样时斑点的直径不超过3 m m，层析缸(筒)内盛有展开剂，滤纸条下端浸人展开剂约1 c m，待溶剂前沿至约 2 0 c m时取出阴干。5.1.3.2 在3 6 5 或2 5 4 n m紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并(a)花及与其同一位置的样品的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加4 m l苯加盖，插入5 0 -6 0 水浴中不G B/T 5 0 0 9.2 7-1 9 9 6时振摇，浸泡 1 5 m i n5.1.4 M il 定5.1.4.1 将样品及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英杯中，以3 6 5 n m为激发光波长，以3 6 5 4 6 0 n m波长进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并(a)花的荧光光谱比 较定性。5.1.4.2 与样品分析的同时做试剂空白，包括处理样品所用的全部试剂同样操作，分别读取样品、标准及试剂空白于波长4 0 6,4 0 6+