GBT 17813-1999 复合预混料中烟酸、叶酸的测定 高效液相色谱法.pdf

G B/r 1 7 8 1 3-1 9 9 9前言 复合预混料中烟酸、叶酸的测定目前尚无国家标准和国际标准，本标准是在查阅国外文献的基础上，经过 试验比较选择了用高效液相色谱法测定复合预混料中烟酸、叶酸。该方法与美国公职分析化学家协会(A O A C)方法比 较，简便、快速，准确度、精密度效果相当。本标准在技术内 容上参照国外方法，确定了标准范围、试剂、测定条件，即反相离子色谱条件和反相缓冲液系统条件。在编写格式上依据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则第1 单元:标准的起草与表述规则 第1 部分:标准编写的基本规定 和G B/T 1.4-1 9 8 8(标准化工作导则 化学分析方法标准编写规定。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人:陈必芳、李兰、梁冬生。中华 人民 共 和 国 国 家标 准复合预混料中烟酸、叶酸的测定 高效液相色谱法G B/T 1 7 8 1 3-1 9 9 9De t e r mi n a t i o n o f n i c o t i n i c a c i d a n d f o l i c a c i d i n c o mp o u n d p r e mi x-Hi g h-p r e s s u r e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y1 范围 本标准规定了复合预混料中烟酸、叶酸的测定高效液相色谱法。本标准适用于复合预混料和维生素预混料中烟酸、叶酸的测定。测量范围为每千克样品中含烟酸的量在1 0 0 0 m g以上，含叶酸的量在5 0 0 m g 以上。2 引用标准 下 列标准中所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理 试样中的烟酸、叶酸用水一 甲醇一 乙酸混合溶液提取，将滤液注人高效液相色谱反相柱上进行分离，用紫外检测器在2 8 0 n m波长处定量测定。4 试剂和材料 除特殊注明 外，本标准所用试剂均为 分析纯.水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合 G B/T 6 6 8 2 的规定4.1 甲醇:优级纯。4.2三乙胺4.3 冰乙酸。4.4烷磺酸钠(P I C B 6):c C C H,(C H r)5 S 0,N a)=0.0 0 5 m o l/I 或 p C C H,(C H.),S O,N a I=9 4 1 m g/I)。4.5 标准溶液配制4.5.1 烟酸标准贮备液:称取经过干燥的烟酸标准纯品2 5.0 m g,N.于2 5 0 m l,棕色容量瓶中，用移动相溶解，稀释至刻度，于冰箱保存，可放置一周。4.5.2 叶酸标准贮备液:称取经过干燥的叶酸标准纯品2 5.0 m g,.于2 5 0 m l容量瓶中，用碳酸钠溶液(4.8)溶解，调至p H 7.。定 容至刻度，于冰箱保存。4.5.3 烟酸、叶酸标准工作液 准确吸取4.5.1 和4.5.2 各1 0 M L，用移动相稀释至5 0 m l或1 0 0 M L.该混合标准溶液置于带盖小瓶贮存，供液相色谱仪分析用，当日使用。国家质量技术监督局1 9 9 9 一 0 8 一 1 0 批准2 0 0 0 一 0 2 一 0 1 实施G s/T 1 7 8 1 3-1 9 9 94.6 提取液:取5 0 0 m L去离子水，加1 0 m L冰乙酸(4.3),1.3 m l三乙胺(4.2)，用去离子水定容至1 I，此时p H为3.2，过0.4 5 p m滤膜，取上述溶液8 5 0 m L与1 5 0 m L甲 醇(4.1)混合4.7 磷酸缓冲液:称取4.8 4 g 的磷酸氢二钾(K,H P 0,),9.8 2 g 磷酸二氢钾(K H,P 0 4),溶于去离子水中，加2 0 m l乙腊，用去离子水定容至1 L,混匀用2 0 0 0 氢氧化钾调节p H至6.5 04.8 碳酸钠溶液:c(N a,C O.,)=0.1 m o l/L.5 仪器、设备5.15.25.35.45.5实验室常用仪器设备。超声波水浴。超纯水装置(Mi l l i p o r e 或全磨口 玻璃蒸馏器)。离心机:3 0 0 0 r/m i n.高效液相色谱仪:带自动进样器、紫外可调波长检验器。6 试样制备 选取有代表性的样品至少5 0 0 g，四分法缩减至1 0 0 g,磨碎，全部通过。.2 8 m m孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7 分析步骇7.1 试验溶液的制备 称取试样维生素预混料0.5-1 g 或复合预混料1-5 g,精确至。.0 0 0 1 g,置于1 0 0 m L 棕色容量瓶中，加 1 0 m L碳酸钠溶液(4.8)，浸湿试样加7 0 m L提取液(4.6)混匀，于超声波水浴上振荡提取1 5 m i n，用提取液定容至刻度，混合均匀，过滤或离心。再经0.4 5 p m过滤膜过滤至带盖小瓶中，调整该试验溶液的浓度(5 p g/m L，供高效液相色谱分析用。7.2 测定7.2.1 色谱条件7.21.1 反相离子对色谱条件 柱长:2 5 c m、内径4.0 m m不锈钢柱。固定相:O D S(C,e)粒度5 k m,移动相:取5 0 0 m L去离子水，加1 0 m l冰乙酸,1.3 m I三乙胺，一小瓶2 0 m I _ 己 烷磺酸钠(4.4),用去离子水定容至1 L，调节p H为3.2，过0.4 5 p m滤膜，取上述溶液8 5 0 m L与1 5 0 m L甲 醇混合，脱气 流速 1.0 m L/m i n,温度:3 0 C。进样量:2 0 讨。检测器:紫外检测器，使用波长2 7 5 n m7.2.1.2 反相色谱 柱长:2 5 c m，内径4 m m，不锈钢柱。固定相:L i c h r o s p h e r C H-8/1 1.,粒度5 p m 移动相:2%乙睛磷酸缓冲液(4.7)流速:1.4 m L/m i n.温度:室温。进样体积:2 0 p L.检测器:紫外检测器，使用波长 2 8 0 n m.G s/T 1 7 8 1 3-1 9 9 97.2.2 定量测定 按高效液相色谱仅说明书调整仪器操作参数和灵敏度(A U F S)，色谱峰分离度符合要求 用两次以上 相应标准工作液对系统进行校正。向色谱柱注入相应的烟酸、叶酸标准工作液(4.5.3 认.)和试验溶液.1 V)得到色谱峰面积响应值(只,P J，用外标法定量测定结果的计算与表述8.1式中计算公式结果按式(1)计算V XP;XV,X.X V.“，.(1)X-只叫-一每千克试样中含烟酸或叶酸的量，m g;m试样质量.g;V一 一提取液的总体积，m l;P 标准溶液中烟酸或叶 酸浓度，p g/m L;V，一 一烟酸或叶酸标准溶液进样体积，p L;v、一从试验溶液中分取的进样体积，p L;尸.-一 与标准溶液进样体积(V,)相应的峰面积响应值;尸 一 一 与从试验溶液中分取的进样体积(V)相应的峰面积响应值。8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3 位。9 允许差同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果相对偏差蕊士l o%e