GBT 27821-2011 化学品 细菌DNA损伤或修复试验方法.pdf

I C S1 3 3 0 0：”1 0 0A8 0圆亘中华人民共和国国家标准G B T2 7 8 2 1 2 0 11化学口口口2 0 11-1 2-3 0 发布细菌D N A 损伤或修复试验方法C h e m i c a l s-B a c t e r i a lD N Ad a m a g eo rr e p a i rt e s t2 0 1 2-0 8 0 0 1 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学右中国国家标准化管理委员会厘1 1 1刖昌G B T2 7 8 2 1 2 0 1 1本标准按照G B T1 12 0 0 9 给出的规则起草。本标准与美国环境保护局(U n i t e dS t a t e sE n v i r o n m e n t a lP r o t e c t i o nA g e n c y，U S E P A)预防、农药及有毒物质办公室(t h eO f f i c eo fP r e v e n t i o n，P e s t i c i d e sa n dT o x i cS u b s t a n c e s，O P P T s)的O P P T S8 7 0 5 5 0 0：1 9 9 8 细菌D N A(脱氧核糖核酸)损伤或修复试验(H e a l t he f f e c tt e s tg u i d e l i n e s-B a c t e r i a lD N Ad a m a g eo rr e p a i rt e s t s)(英文版)技术性内容一致。本标准做了下列结构和编辑性修改：介绍部分改为引言；增加了范围一章(见第1 章)。本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(S A C T C2 5 1)提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。本标准主要起草人：刘清君、李朝林、林铮、史晓禧、吴维皑。标准分享网 w w w.b z f x w.c o m 免费下载6 B T2 7 8 2 1 2 0 11引言本标准参考了U S E P AO P P T S8 7 0 5 5 0 0：1 9 9 8 细菌D N A(脱氧核糖核酸)损伤或修复试验(英文版)。该指南是美国环境保护局(U n i t e dS t a t e sE n v i r o n m e n t a lP r o t e c t i o nA g e n c y，U S E P A)预防、农药及有毒物质办公室(t h eO I f i c eo fP r e v e n t i o n，P e s t i c i d e sa n dT o x i cS u b s t a n c e s，O P P T S)制定，用来评价农药和其他有毒物质安全性的系列测试指南之一。是O P P T S 整合了三个相关部门的测试指南和要求而最终形成，这三个相关部门的测试指导分别是依据美国联邦法规(C o d eo fF e d e r a lR e g u l a t i o n s，T i t l e4 0)，第一章的R 部分的污染预防和有毒物质办公室(t h eO I f i c eo fP o l l u t i o nP r e v e n t i o na n dT o x i e s，O P P T)制定的测试指南和要求，美国国家情报社出版的(t h eN a t i o n a lT e c h n i c a lI n f o r m a t i o nS e r v i c e，N T I S)农药规划办公室(t h eO I f i c eo fP e s t i c i d eP r o g r a m s，O P P)的测试指南和要求，以及世界经济合作与发展组织(t h e0 r g a n i z a t i o nf o rE c o n o m i cC o o p e r a t i o na n dD e v e l o p m e n t，O E C D)出版的测试指南。依据有毒物质控制法规(t h eT o x i cS u b s t a n c e sC o n t r o lA c t，1 5 U S C 2 6 0 1)和联邦杀虫剂、杀真菌剂和杀啮齿类动物剂法规(t h eF e d e r a lI n s e c t i c i d e，F u n g i c i d ea n dR o d e n t i c i d eA c t(7US c 1 3 6，e ts e q)，为满足对测试数据的要求，U S E P A 把多套指南整合而形成一套最终的O P P T S 测试指南，以降低不同测试程序引起的差异。标准分享网 w w w.b z f x w.c o m 免费下载1 范围化学品细菌D N A 损伤或修复试验方法G B T2 7 8 2 1 2 0 11本标准规定了化学品细菌D N A 损伤或修复试验的试验原理、试验方法、试验步骤和试验数据及报告。本标准适用于化学品细菌D N A 损伤或修复试验。2 试验原理细菌D N A 损伤或修复试验可用来测试D N A 损伤，在一套修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株试验中，修复缺陷菌株的细胞死亡和生长抑制表现不同。该试验本身并不是用来测量突变事件，商是通过检测受试物与遗传物质的相互作用检测其遗传毒性。通过检测修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株表现出的不同的生长抑制作用，测试化学品对修复功能健全的野生型菌株和修复功能缺陷的突变型菌株不同的致细胞死亡作用。修复功能缺陷的突变型菌株通常是一种或多种调控D N A 损伤修复酶缺陷的菌株。本测试方法可用来检测化学品是否能够与细胞D N A 反应导致细胞生长抑制或致死亡作用。化学品与D N A 的相互作用可以通过特异的细胞修复系统识别。本方法选择特异D N A 修复基因完好和缺陷的一对菌株，由于D N A 修复缺陷菌株不能修复某一化学品引起的D N A 损伤，其表现为细胞趋向于生长抑制或趋向于死亡。本方法的参考物质包括但不限于氯霉素(c h l o r a m p h e n i c 0 1)和甲基磺酸甲酯(m e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e)。3 试验方法3 1 方法的选择可选用不同的方法进行测试，本方法宜选用以下两种方法a)在固相基质上进行的测试(扩散试验)；b)在液相基质上进行的测试(悬浮试验)。3 2 菌株选择3 2 1 常用菌株宜选择大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l ip o l A，W 3 1 1 0 p 3 4 7 8)和枯草杆菌(B a c i l l u ss u b t i l i sr P c，H 1 7 M 4 5)。也可选择其他菌株。3 2 2 菌株的准备和保存菌株保存液的准备和保存、生长条件、菌株的鉴定以及所需表型的验证等都应采用良好的微生物试验方法，而且都应记录在案。标准分享网 w w w.b z f x w.c o m 免费下载G B T2 7 8 2 1 2 0 1 13 3 菌株的培养应选用良好的微生物方法，使用新鲜的细菌培养物培养细菌。记录细胞所处的生长期和细胞密度，满足实验设计的要求。3 4 代谢活化应设置加与不加代谢活化系统的平行对照组。常用的代谢活化系统是经酶诱导剂(物)处理过的啮齿类动物的肝匀浆微粒体酶系。也可选用其他种属、组织或方法。3 5 对照组3 5 1 平行对照每一次试验都应设置阳性对照、阴性对照和溶剂对照。3 5 2 阴性对照阴性对照应不表现出明显的生长抑制作用(即对两种菌株的影响是相同的)。常选氯霉素。3 5 3 基因型特异对照可选用甲基磺酸甲酯作为大肠杆菌试验的基因型特异阳性对照，选用丝裂霉素作为枯草杆菌试验的基因型特异阳性对照。3 5 4 阳性对照用来保证代谢活化系统的有效性试验的阳性对照参考物质，包括代谢活化系统应根据试验选用的活化系统类型确定。3 5 5 其他阳性对照可选择其他阳性对照参考物质。3 6 受试物3 6 1 溶剂受试物、阳性对照和阴性对照都应溶解在恰当的溶剂中，试验前用溶剂稀释备用。3 6 2 染毒浓度最初试验应选择较宽的染毒浓度范围，染毒的上限浓度的选择应根据细胞毒性的结果和受试物的溶解性来确定。受试物的细胞毒性结果受代谢活化系统的影响。对于溶解性高的无毒化学品，应根据具体情况逐步确定最高剂量。因为扩散试验的结果以获得的生长抑制作用带的直径或范围表示，所以培养皿或培养板中加入的受试物的量应完全一致。如有阳性反应，应用更窄浓度范围进行重复确认。4 试验步骤4 1 扩散试验4 1 1 培养皿扩散试验培养皿扩散试验可采用两种方法2标准分享网 w w w.b z f x w.c o m 免费下载G B T2 7 8 2 1 2 0 1 1a)琼脂中加入单一菌株进行铺板或把菌株涂在琼脂表面，受试物加在琼脂表面的滤纸上；b)D N A 修复功能健全的菌株和修复功能缺陷菌株划在同一琼脂表面，把含有受试物的培养皿置于琼脂表面，与细菌接触。4 1 2 培养板扩散试验在培养板扩散试验中，既可把细菌加在琼脂中铺板也可把细菌涂在琼脂表面，把受试物溶液加在含琼脂的培养板中。4 2 悬浮试验4 2 1用受试物对细菌悬液进行染毒，根据细菌存活量(克隆形成数)判断受试物的作用是依赖于时间还是依赖于浓度。4 2 2 对于澄清的细菌悬液，可用一系列的受试物稀释液染毒，得出每一菌株最低的抑制浓度，并可通过观察培养后是否出现可见的生长现象来验证。4 2 3 可使用单一剂量的受试物处理成对的细菌悬液(通常最初是浑浊的)，通过比较浑浊度增加速率的改变判断不同的抑制作用，得出阳性结果。4 3 培养的数量如选用培养皿扩散试验，每一稀释度至少应在两个单独的培养皿进行试验。对于液体悬浮试验，至少应使用两个独立的样本确定存活细胞的数量。4 4 培养条件试验的所有培养皿都应采用相同的培养条件，通常为3 7，1 8h 2 4h。5 试验数据和报告5 1 结果处理5 1 1 扩散试验应以生长抑制带的直径(以m m 计)或生长抑制带的范围(以m m 2 计)表示结果，如果有剂量一反应数据，应使用相同的单位。5 1 2 液体悬浮试验5 1 2 1以剂量一反应形式给出菌株的存活数据，宜给出每一菌株存活百分数或存活比例，或者给出两种菌株的相对存活比例。5 1 2 2 结果也可表示为一定存活率的浓度(如D。，表示3 7 存活的浓度)。该数据来源于存活曲线。浓度应以单位体积的量表示，即摩尔浓度。5 1 2 3 结果还可表示为最小抑制浓度或最小致死浓度。根据液体培养基中是否出现可见的生长得出最小抑制浓度；根据半固体培养基上的受试物稀释浓度得出最小致死浓度。5 1 3 原始数据所有的试验中，浓度应以试验处理时的最终浓度表示，并提供原始数据，包括实际测试数，如净值。对于扩散试验，应说明培养皿或培养板的直径，测量结果应说明是否减去了培养皿或培养板的直径。此外，还应说明受试物是否出现快速，弥散及双向的生长抑制带。如果出现了双向生长抑制带，应说明对3标准分享网 w w w.b z f x w.c o m 免费下载G B T2 7 8 2 1-2 0 1 1内带和外带是否都进行了测量。5 1 4 活性计数以某一稀释度下培养皿真正的计数和涂板的体积或原始滴度(细胞数每毫升)表示。不应仅提供最终的结果(如比率、差异、存活比)，而不提供原始试验数据。5 2 统计评价应选用恰当的统计方法进行评价。5 3 结果的判断5 3 1阳性结果的判断有多个标准。其一为修复缺陷菌株出现具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异。另一标准为至少在一个测试点，出现可重复的、具有统计学意义的阳性反应。5 3 2 如果某一受试物在修复缺陷菌株上未见具有统计学意义的剂量相关的抑制趋势或死亡差异，在所有的测试点，也没表现出可重复的、具有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物与所用试验系