GBT 17999.5-1999 SPF鸡酶联免疫吸附试验.pdf

G B/T 1 7 9 9 9.5-1 9 9 9前言 酶联免疫吸附试验(E L I S A)是国外监测S P F 鸡淋巴白血病病毒感染的通用方法。我国建立的淋巴白血病E L I S A方法敏感性高、特异性强、重复性好，已广泛用于商品种鸡场淋巴白血病的净化和S P F鸡场淋巴白血病病毒感染的监测，本标准在此基础上，规定了S P F鸡酶联免疫吸附试验。S P F A 鸟 微生物学质量控制国家系列标准，包括S P F鸡微生物学监测总则和9 种S P F鸡微生物学检测方法。本标准为(S P F鸡酶联免疫吸附试验。S P F 鸡微生物学检测方法还包括以下部分:G B/T 1 7 9 9 9.1-1 9 9 9 S P F 鸡 红细胞凝集抑制试验;G B/T 1 7 9 9 9.2-1 9 9 9 S P F 鸡血清中和试验;G B/T 1 7 9 9 9.3-1 9 9 9 S P F 鸡 血清平板凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.4-1 9 9 9 S P F鸡琼脂扩散试验;G B/T 1 7 9 9 9.6一 1 9 9 9 S P F鸡胚敏感试验;G B/T 1 7 9 9 9.7-1 9 9 9 S P F 鸡 鸡白 痢沙门氏 菌检验;G B/T 1 7 9 9 9.8-1 9 9 9 S P F 鸡 试管凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.9-1 9 9 9 S P F 鸡 间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位:农业部实验动物研究中心。本标准主要起草人:陈德威、张冰、赵立红、黄进、李军。中华人民共和国 国家标准S P F鸡酶联免疫吸附试验G B/T 1 7 9 9 9.5 一 1 9 9 9S P F c h i c k e n-E n z y me-l i n k e d i mmu n o s o r b e n t a s s a y1 范围本标准规定了酶联免疫吸附试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于S P F鸡感染淋巴白血病病毒后的群特异性抗原的监测。2 原理 检测S P F鸡蛋清中禽白血病病毒主要群特异性抗原P 2 7 的方法为双抗体夹心酶联免疫吸附试验。先用抗P 2 7 抗体包被酶标板，然后与蛋清作用，蛋清中的P 2 7 与包被抗体结合，洗去未结合的物质。再加入H R P兔杭P 2 7 抗体，作用后洗去未结合的酶标物 加入底物溶液，出现颜色变化。颜色变化的速度及程度与样品中P 2 7 的含量有关3 试剂和器材3.1 试剂3-1 门包被抗体(兔抗P 2 7 I g G),11.2 R H 性抗原(P 2 7)。3 门.3 阴性抗原。3.1.4 被检蛋清。3.1.5 H R P-兔杭P 2 7 o3.1.6 包被液:。.0 5 m o t/Ip H 9.6 碳酸盐缓冲液配制 碳酸钠 1.5 9 g,碳酸氢钠 2.9 3 g,蒸馏水加至1 0 0 0 M I3.1.7 洗涤液:p H7.4,P B S-T We e n 2 0 配制,0.0 1 m0 I/I _,P H7.4 P B S 1 0 0 0 mL，吐温-2 0。.3 MI3,1.8 底物溶液:p H 5.。磷酸盐一 柠檬酸缓冲液一 O P D-H,O,配制。.2 m o l/I磷酸氢二钠溶液 2 5.7 m I0.1 m o t/I柠檬酸溶液2 4.3 m l，蒸 馏水5 0 M I，邻苯二胺(O P D)4 0 m g,3 0%H,0,0.1 5 m lI，.9 终止液:2 m o l/I硫酸。3.2 器材3.2.1 酶标板。3.2.2 移液器。12.3 恒温培养箱。3.2.4 F I A S A读数仪4 操作程序4.1 抗体包被 用包被液将免杭P 2 7 1 g G作适当稀释，每孔1 0 0 p L,4 C 过夜。国家质量技术监督局 1 9 9 9 一 1 1 一，0 批准2 0 0 0 一 0 4 一 0 1 实施G B/r 1 7 9 9 9.5 一1 9 9 94.2 洗涤:甩去包被液，每孔加满洗涤液(约3 0 0 p i)，静置3 m i n，甩干，如此重复3 次4.3 加样:每孔加1 0 0 p I 被检蛋清，设阳性、阴 性对照孔，每个样品加两孔，3 7 C 作用6 0 m i n 甩去样品，洗涤同上。4.4 侮孔加H R P 一 免抗P 2 7(工作浓度)1 0 0 p L,3 7 C 作用4 5 m i n-6 0 m i n，甩去H R P 一 兔抗P 2 7 液，洗涤同 卜4.5 加底物溶液:每孔加 1 0 0 k L新配制的底物溶液，避光作用 1 5 mi n4.6 终止反应:每孔加终止液1 0 0 1.1。4.7 读O D值:终止反应后，迅速置E L I S A读数仪上 于4 9 0 n m处读出各孔的O D值。5 结果判定5.1 当阳性对照O D值与阴性对照O D值之差大于或等于。.3 时，试验结果可靠。5.2 按式(I)计算被检样品的S/P比值:S/P=S 一 一样品O D值;P阳性对照O D值样品O D值均数 一阴性对照O D值均数阳性对照O D值均数一阴性对照O D值均数.。一(1)式中:5.3判定:S/P 奏0.2，判为阳性;S/PGO.2，判为阴性口