GBT 17480-1998 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法.pdf

G B/T 1 7 4 8 0-1 9 9 8前言 酶联免疫吸附(E L I S A)法测定黄曲 霉毒素B,(A F B,)，是近2 0 年来发展起来的一种新的分析方法。它比 原G B 8 3 8 1-8 7 薄层荧光限量法(半定量)测定A F B，具有技术先进、灵敏度高、特异性强、精确度高、重复性好、测定速度快、成本低、污染少等优点。其原理是通过A F B,抗体与酶标A F B,抗原和待测抗原之间免疫竟争反应以及酶的催化显色反应相结合来检测样品中A F B，的含量。国外已 研制成专门的测试盒供检测部门使用，如美国A g r i-S c r e e n 等公司就有这种产品。本标准等效采用A O A C(美国公职分析化学家协会)中关于棉籽制品和混合饲料中A F B,酶联免疫吸附筛选法，该法 1 9 8 9 年首次在A O A C上获得通过。本标准为饲料中A F B，限量和定量测定法.可与原G B 8 3 8 1-8 7 标准并列使用，而以原标准为仲裁法。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由 江苏省微生物研究所、上海市饲料质量监督检验站、国家饲料质量监督检验中心(北京)、上海市嘉定纤检仪器厂共同组成的起草工作组负责起草。本标准主要起草人:成恒篙,潘中华、张瑜、陈必芳、必晓黎、赵晓联、袁建兴、杨众、徐燕芳、葛其德。中华 人 民 共 和 国 国家 标 准饲料中 黄曲霉毒素B l 的测定 酶联免疫吸附法G B/T 1 7 4 8 0-1 9 9 8D e t e r m i n a t i o n o f a f l a t o x i n B,i n-E n z y m e-l i n k e d i m mu n o s o r b e n t1 范围 本标准规定了 饲料中 黄曲霉毒素B,(A F B,)的酶联免疫吸附测定(E L I S A)方法。本标准适用于各种饲料原料、配(混)合饲料中A F B:的测定。2 引用标准 G B 8 3 8 1-8 7 饲料中 黄曲 霉毒素B，的测定方法3 原理 利用固相酶联免疫吸附原理，将A F B,特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入样品提取液(未知抗原)及酶标A F B，抗原(已知抗原)，使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标A F B,抗原结合的量，即样品中A F B,多，则被抗体结合酶标A F B,抗原少，颜色浅，反之则深。用目 测法或仪器法与A F B，标样比 较来判断样品中A F B,的含量。4 试荆和材料4.1 A F B,酶联免疫测试盒组成4.1.1 包被抗体的聚苯乙烯微量反应板:2 4 孔或 4 8 孔。4.1.2 A试剂:稀释液，甲 醉:蒸馏水为7:9 3(V/V).4.1.3 B 试剂:A F B，标准物质(S i g m a 公司，纯度1 0 00)溶液，1.0 0 p g/L o4.1.4 C试剂:酶标A F B，抗原(A F B,辣根过氧化物酶交联物，A F B,-H R P),A F B,:H R P摩尔比)2 06 3 08 4 01 0 5 06.4 定量测定 若试样超标，则用A F B,测定仪或酶标测定仪在4 5 0 n m波长处进行定量测定，通过绘制A F B,的标准曲线来确定试样中A F B，的含量。将5 0.0 0 p g/L的A F B，标准溶液用A试剂稀释成。.0 0,0.0 1,0.1 0,1.0 0,5.0 0,1 0.0 0,2 0.0 0,5 0.0 0 p g/L的标准工作溶液，分别作为B 试剂系列，按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值A;以。p g/L A F B，浓度的A。值为分母，其他标准浓度的A值为分子的比 值，再乘以1 0。为纵坐标，对应的A F B，标准浓度为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。根据试样的A值/A。值，乘以1 0。的值在标准曲线上查得对应的A F B,量，并按式(1)计算出试样中A F B的含量。G B/T 1 7 4 8 0-1 9 9 8x _p V n式中:r 一一 每千克试样中A F B，的含量，K g;p 从标准曲线上查得的试样提取液中A F B，含量,k g/1;V试样提取液体积,m L;二 试样稀释倍数 。试样的质量,g o7 柑确度 重复测定结果相对偏差不得超过1 0%e8 其他8.1 测试盒应放在4 -8 冰箱内保存，不得放在。以下的冷冻室内保存。8.2 测试盒有效期为6 个月。8.3 凡接触A F B，的容器，需浸人1%次抓酸钠(N a C I O,)溶液，半夭后清洗备用。8.4 为分析人员安全，操作时要带上医用乳胶手套。