GB 5413.15-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定.pdf

中华人民共和国中华人民共和国国家标准国家标准GB 5413.152010中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定National food safety standard Determination of vitamin niacin and niacinamide in foods for infants and young children,milk and milk products GB 5413.152010 I 前 言 本标准第二法等同采用国际分析家学会（AOAC）944.13 Niacin and Niacinamide(Nicotinic Acid and Nicotinamide)in Vitamin Preparations。本标准代替GB/T 5413.15-1997婴幼儿配方食品和乳粉 烟酸和烟酰胺的测定。本标准第二法与GB/T 5413.15-1997相比，主要变化如下：增加了光密度法测定；增加了淀粉类试样的测定；增加标准曲线绘制的文字描述。本标准附录 A 为资料性附录。本标准代替标准的历次版本发布情况为：GB 5413-1985、GB/T 5413.15-1997。GB 5413.152010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定。2 规范性引用性文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。第一法 高效液相色谱法 3 原理 试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后，以 C18 色谱柱分离，用紫外检测器定量。4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 淀粉酶：酶活力1.5 U/mg。4.2 盐酸。4.3 氢氧化钠。4.4 盐酸(2.4 mol/L)：准确移取 10 mL 盐酸（4.2）于 50 mL 容量瓶中，用水定容。4.5 氢氧化钠溶液（2.5 mol/L）：称取 5.0g 氢氧化钠（4.3）于 50 mL 容量瓶中，用水定容。4.6 高氯酸（HClO4）：体积分数为 60%。4.7 甲醇（CH4O）：色谱纯。4.8 异丙醇(C3H8O)：色谱纯。4.9 庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S)：优级纯。4.10 标准溶液 4.10.1 烟酸及烟酰胺标准储备液（1.0 mg/mL）：称取烟酸及烟酰胺标准品各 0.1 g（精确到 0.0001 g），分别置于 100 mL 容量瓶中，用水溶解定容。4.10.2 烟酸及烟酰胺混合标准中间液（40 g/mL）：分别准确吸取烟酸及烟酰胺标准储备液（4.10.1）2 mL 至 50 mL 定量瓶中，用水定容。临用前配制。GB 5413.152010 2 4.10.3 烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液：分别准确吸取烟酸及烟酰胺混合标准中间液（4.10.2）0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL，至 50 mL 容量瓶中用水定容。该标准系列浓度分别为 0.00 g/mL、0.80 g/mL、1.60 g/mL、4.00 g/mL、8.00 g/mL。临用前配制。5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪，带紫外检测器。5.2 pH 计：精度为 0.01。5.3 超声波振荡器。5.4 天平：感量为 0.1 mg。5.5 培养箱：30 80。6 分析步骤 6.1 试样的预处理 6.1.1 含淀粉的试样：称取混合均匀固体试样约 5.0 g（精确到 0.0001 g）加入约 25 mL 45 50 的水，或称取混合均匀液体试样约 20.0 g（精确到 0.0001 g）于 150 mL 锥形瓶中，再加入约 0.5 g 淀粉酶（4.1），摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上瓶塞，置于 50 60 的培养箱内培养约 30 min，取出冷却至室温。6.1.2 不含淀粉的试样：称取混合均匀固体试样约 5.0 g（精确到 0.0001 g）加入约 25 mL 45 50 的水，或称取混合均匀液体试样约 20.0 g（精确到 0.0001 g）于 150 mL 锥形瓶中，振摇，静置 5 min10 min，充分溶解，并冷却至室温。6.1.3 提取：将上述锥形瓶置于超声波振荡器中振荡约 10 min。6.1.4 沉淀及定容：待试样溶液降至室温后，用盐酸（4.4）调节试样溶液的 pH 值至 1.7 0.1，放置约2 min 后，再用氢氧化钠溶液（4.5）调节试样溶液的 pH 值至 4.5 0.1。将试样溶液转至 50 mL 容量瓶中，用水反复冲洗锥形瓶，洗液合并于 50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后经滤纸过滤，滤液再经 0.45 m 微孔滤膜加压过滤，用试管收集，即为试样待测液。6.2 参考色谱条件 色谱柱：C18 柱（粒径5 m，150 mm 4.6 mm）或具有同等性能的色谱柱。流动相：甲醇（4.7）70 mL，异丙醇（4.8）20 mL，庚烷磺酸钠（4.9）1 g，用910 mL水溶解并混匀后，用高氯酸（4.6）调pH至2.1 0.1，经0.45 m膜过滤。流速：1.0 mL/min。检测波长：261 nm。柱温：25。进样量：10 L。6.3 定量分析 6.3.1 标准曲线绘制 将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液（4.10.3）依次进行色谱测定（其标准样品色谱图参见附录 A中图 A.1.1）。记录各组分的色谱峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。GB 5413.152010 3 6.3.2 试样测定 将试样待测液（6.1.4）进行色谱测定。记录各组分色谱峰面积或峰高，根据标准曲线计算出试样待测液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度 ci。7 分析结果的表述 7.1 试样中烟酸或烟酰胺含量的计算 试样中烟酸或烟酰胺的含量按（1）式计算：mVcXi10021=或（1）式中：X1或2试样中烟酸或烟酰胺的含量，单位为微克每百克（g/100 g）；m试样的质量，单位为克（g）；ci试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V试样溶液的体积，单位为毫升（mL）。7.2 试样中维生素烟酸总含量的计算 试样中维生素烟酸的总含量按（2）式计算：X 12XX+（2）式中：X试样中维生素烟酸的总含量，单位为微克每百克（g/100 g）；X1试样中烟酸的含量，单位为微克每百克（g/100 g）；X2试样中烟酰胺的含量，单位为微克每百克（g/100 g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。第二法 微生物法 9 原理 利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014 对烟酸和烟酰胺的特异性，在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长产生的酸度和形成的光密度来测定烟酸和烟酰胺的含量。10 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。10.1 硫酸溶液 A（10 mol/L）：将质量分数为 95%98%的浓硫酸 560 mL 缓慢加入到 600 mL 水中，边加边搅拌，冷却后定容至 1000 mL。GB 5413.152010 4 10.2 硫酸溶液 B（1 mol/L）：吸取 100 mL 10 mol/L 的硫酸溶液 A（10.1），转移至 1000 mL 容量瓶用水定容。10.3 氢氧化钠溶液 A（3.75 mol/L）：称取 150 g 氢氧化钠于 1000 mL 烧杯中，用 400 mL 水溶解，冷却至室温后，转移至 1000 mL 容量瓶中，用水定容。10.4 氢氧化钠溶液 B（0.375 mol/L）：吸取 100 mL 氢氧化钠溶液 A（10.3）转移至 1000 mL 容量瓶用水定容。10.5 氢氧化钠标准滴定溶液（0.1 mol/L 0.0002 mol/L）：称取 4g（精确至 0.0001 g）氢氧化钠用水稀释至 1000 mL，用邻苯二甲酸氢钾标定。保存此溶液的容器要密封，以防二氧化碳渗透。10.5.1 氢氧化钠标准溶液的标定：称取约 0.18 g（精确至 0.0001 g）于 105 110 烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，用 50 mL 除二氧化碳的水溶于锥形瓶中，加两滴 5 g/L 的酚酞指示剂，用配好的氢氧化钠溶液滴定至粉红色，同时作空白实验。氢氧化钠标准溶液的浓度为：c=2042.0)(m21VV(3)式中：c氢氧化钠的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m邻苯二甲酸氢钾的质量，单位为克（g）；V1氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）；V2空白试验氢氧化钠溶液的用量，单位为毫升（mL）。10.5.2 酚酞溶液：称取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 体积分数为 95%的乙醇中，并加入 20mL 水，加入氢氧化钠标准滴定溶液（10.5），直至加入一滴立即变成粉红色，再加入水定容至 100 mL。10.6 盐酸（0.1 mol/L）：吸取 8.3 mL 盐酸，用水稀释至 1000 mL。10.7 乙醇溶液：体积分数为 25%。量取 250 mL 无水乙醇，加入 750 mL 水，混匀。10.8 菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC 8014。10.9 培养基（或可使用商品化的合成培养基）10.9.1 乳酸杆菌琼脂培养基：光解胨 15 g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氢钾 2 g，聚山梨糖单油酸酯 1 g，琼脂 10 g，加蒸馏水至 1000 mL，pH6.8 0.2（20 25）。121高压灭菌 15min，备用。10.9.2 乳酸杆菌肉汤培养基：光解胨 15g，葡萄糖 10 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氢钾 2 g，聚山梨糖单油酸酯 1 g，加蒸馏水至 1000 mL，pH 6.8 0.2（20 25）。121高压灭菌 15min，备用。10.9.3 烟酸测定用培养基：维生素测定用酸水解酪蛋白氨基酸（Casamino Acids）12 g，葡萄糖 40 g，乙酸钠 20 g，L-胱氨酸 0.4 g，DL-色氨酸 0.2 g，盐酸腺嘌呤 20 mg，盐酸鸟嘌呤 20 mg，尿嘧啶 20 mg，盐酸硫胺素 200 g，泛酸钙 200 g，盐酸吡哆醇 400 g，核黄素 400 g，p-氨基苯甲酸 100 g，生物素0.8 g，磷酸氢二钾 1 g，磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁 0.4 g，氯化钠 20 mg，硫酸亚铁 20 mg，硫酸锰 20 mg。加蒸馏水至 1000 mL，调 pH 至 6.7 0.2（20 25）。10.10 标准溶液 GB 5413.152010 5 10.10.1 烟酸标准贮备液（100 g/mL）：在五氧化二磷干燥器中取出已干燥的烟酸标准品，称取 50.0 mg(精确至 0.1 mg)，用乙醇溶液（10.7）溶解并定容至 500 mL，2 4 冰箱冷藏，保存期为 4 个月。10.10.2 烟酸标准中间溶液（10 g/mL）：从烟酸标准贮备液（10.10.1）中吸取 10 mL 至 100 mL 容量瓶，用乙醇溶液（10.7）定容，2 4 冰箱冷藏，保存期为 1 个月。10.10.3 烟酸标准工作液（100 ng/mL）：从标准中间液（10.10.2）中吸取 5.0 mL，用水稀释至 500 mL。临用前配制。10.11 0.9%生理盐水：称 0.9 g 氯化钠于 100 mL 容量瓶中，稀释至刻度，振荡溶解。分装于具塞试管中，每管 10 mL，121 灭菌 15