GB 15193.6-2003 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验.pdf

I C S 0 7.1 0 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB 1 5 1 9 3.6-2 0 0 3代替 G B 1 5 1 9 3.6-1 9 9 4A 甫 乳动物骨髓细胞染色体畸变试验Ma mma l i a n b o n e ma r r o w c e l l c h r o mo s o mea b e r r a t i o n t e s t2 0 0 3-0 9-2 4发布2 0 0 4-0 5-0 1 实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB 1 51 9 3.6-2 0 0 3前言 本标准全文强制 本标准代替G B 1 5 1 9 3.6-1 9 9 4 骨髓细胞染色体畸变试验 本标准与G B 1 5 1 9 3.6-1 9 9 4 相比的主要修改如下:将标准名称“骨髓细胞染色体畸变试验”改为“哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验”;在“范围”中 增加了受试物的 具体内 容:食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中 所涉及的可能 对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂(含营养强化剂)、食品新 资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等;增加不适用范围;将原操作步骤中“5.1 动物处理”标题下的有关内容分列为“试验动物”、“剂量及分组”和“操 作 步 骤”三 章;增加章题“试验动物”，将“取健康成年大、小鼠”改为“常用健康年轻的成年大鼠或小鼠”;增加章题“剂量及分组”，并将高剂量组的设计方法增加一条“急性毒性试验给予受试物最大剂 量(最大使用浓度和最大灌胃 容量)求不出L D s。时 高剂量组则按以下顺序 a)1 0 g/k g 体 重;b)人的可能摄人量的 1 0。倍;或 c一次最大灌胃刘量进行设计”;增加参考阳性对照 物“丝裂霉素C O.5 m g/k g 体重2.0 m g/k g 体重)，或环磷酞胺(4 0 m g/k g 体重)”;将原 5.1.2”剂量设计以外的内容放在增加的“操作步骤”标题下，并在此标题下增加“受试物 配制”的有关内容;增加“结果判定”内容 自本标准实施之日起，GB 1 5 1 9 3.6-1 9 9 4同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、哈尔滨医科大学、杭州市卫生防疫站。本标准主要起草人:韩驰、唐玲光、袁振华。本标准于1 9 9 4 年首次发布，本次为第一次修订。GB 1 5 1 9 3.6-2 0 0 3哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验范围 本标准规定了哺乳动物骨1im染色体畸变试验的基本技术要求 本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素对大、小鼠 骨髓细胞的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂(含营养强化剂)、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与 包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等 本标准不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物达不到靶组织(t a r g e t t i s s u e)-骨髓的情况，2 原理 染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G 1 期和s 期时，诱发染色体型畸变，而作用于G 2 期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小鼠腹腔注人秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩知、分散，轮廓清晰.在显微镜下观察染色体数口 和形态3 仪器与试剂 全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为燕馏水3.1 0.1%秋水仙素:笠于 棕色瓶中，冰箱保存3.2 2.2%柠檬酸钠3.3 p H 7.4 磷酸盐缓冲液3.3.1 1/1 5 m o l/L 磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠(N a e H P O,A 4 7 g 溶于1 0 0 0 m L 蒸馏水中3.3.2 1/1 5 m o l/L 磷酸二氢钾溶液:磷酸二氢钾(K H.,P O,)4 9.0 7 g 溶于1 0 0 0 m 1-燕馏水中3.3.3 将磷酸氢二钠溶液8 0 m l 与磷酸二氢钾溶液2 0 m L 混合，用p H计测定并调节p F I 至7.43.4 0.0 7 5 m o l/L氯化钾溶液。3.5 甲醇(分析纯):冰乙酸(分析纯)以3，1 混合，临用时现配3.6 G i e m s a溶液3.6.1 G i e m s a 储备液:取G i e m s a 染料3.8 g,置玛瑙乳钵中，加少量甲 醇研磨，逐渐加甲醇至3 7 5 m L溶解后再加1 2 5 m L 纯甘油，于3 7 0C 温箱保温4 8 h在此期间摇动数次 放置1 周-2 周过滤备用3.6.2 G i e m s a 应用液:取1 m 工 储备液加入1 0,L p H 7.4 磷酸缓冲液3 7 4 V 器与设各 寒盼室常用设备、恒温水洛锅(3 7 士5 0C),离心机、生物显微镜，4 实验动物常用健康年轻的成年大鼠 或小鼠。每组用两种性别的动物至少各5 只。动物购买后适应环境至少3天5 荆量及分组 受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上 为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取工/2 L D,，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4 和1/8 L D。作为中、低剂量 急性毒性试验给予受试物最大剂量(最大使用浓度和最大灌胃 容量)动物无死亡而求不出L D。时，高剂量组则按以 51GB 1 51 9 3.6-2 0 0 3下顺序:a)中、低剂量组1 0 g/k g 体重;b)人的可能摄人量的1 0。倍;或c)一次最大灌胃剂量进行设计，再下设。另设溶剂对照组和阳性对照组，阳性物可用丝裂霉素C(1.5 m g/k g 体重2.0 m g/k g体重)或环磷酞胺(4 0 m g/k g 体重)经口或腹腔注射(首选经口)给予。6操作步骤6.1 受试物配制 一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、狡甲基纤维素配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。6.2 实验动物的处理 经口给予受试物2 次4 次，每次间隔2 4 h，在末次给受试物后1 8 h-2 4 卜 取材。必要时可先用一个剂量的3 只动物，于给受试物后 6,2 4,4 8 h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用 1 5 只动物，于6,2 4,4 8 h 后分别各处死5只动物取材。处死动物前 2h4 h，按4 m g/k g 体重腹腔注人秋水仙素。大鼠断头处死，小鼠 颈椎脱臼。6.3 标本制备6.3.1 取材 取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨髓，用带针头的注射器吸取 2 m L-4 mL 2.2%柠檬酸钠溶液，将骨髓洗人 1 0 m L离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以 1 0 0 0 r/m i n -1 5 0 0 r/m i n 离心 1 0 m i n，弃去上清液。6.3.2 制片 离心后的沉淀物加人4 mL O.0 7 5 mo l/L氯化钾溶液，混匀后在3 7 水浴或恒温箱中放置1 0 mi n-2 0 m i n，再以1 0 0 0 r/mi n-1 5 0 0 r/m i n 离心，弃去上清液。将新配制的甲醇一 冰乙酸固定液4 m L沿管壁加人受试物中，1 0 m i n-1 5 mi n后，用吸管将细胞团块打碎继续固定 1 0 m i n-1 5 mi n，以 1 0 0 0 r/mi n离心 1 0 m i n弃去上清液，再加固定液 4 m L静置2 0 mi n 后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成。.5 m1 _-1.0 ml细胞悬液。先将洗净的载玻片保存于冰水中备用。自冰水中取出载玻片，倾斜 3 0 放置，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3 处滴 3 滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制 2张一3张玻片，空气中自然干燥 临用时取G i e m s a 储备液1 m L,磷酸盐缓冲液1 0 m L，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色 1 5 m i n左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。6.4 阅片6.4.1 阅片要求 在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析 1 0。个中期相细胞，每个剂量组不少于 1 0 0 0 个中期相细胞。6.4.2 观察项 目6.4.2.1 染色体数目的改变6.4.2.1.1 非整倍体:亚二倍体或超二倍体6.4.2.1.2 多倍体:染色体成倍增加6.4.2.1.3 内复制:包膜内的特殊形式的多倍化现象6.4.2.2 染色体结构的改变6.4.2.2.1 断裂:损伤长度大于染色体的宽度。6.4.2.2.2 微小体:较断片小而呈圆形6.4.2.2.3 有着丝点环:带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。5zGB 1 51 9 3.6-2 0 0 36.4.2.2.46.4.2.2.56.4.2.2.66.4.2.2.76 _ 4.2.2.8无着丝点环:成环状结构。单体互换:形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。双微小体:成对的染色质小体。裂隙:损伤的长度小于染色单体的宽度。非特定性型变化:如粉碎化、着丝点细长化、粘着等7 数据处理统计学处理用 XZ 检验。8 结果判定 试验组与对照组相比，试验结果染色体畸变率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复者可确定 为阳性。