GBT 14700-1993 饲料中维生素B1测定方法.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准饲 料 中维 生 素 B l测 定 方 法G B/T 1 4 7 0 0 一 9 3Me t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f v i t a mi n B,i n f e e d s1 主题内容与适用范围本标准规定了 饲料中维生素B，的测定方法。本标准适用于 饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B，的测定。萃取液的浓度范围为。.0 2-0.2 Ti g/m l(在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质的 情况下.本标准不适用)2 引用标准G B 6 6 8 2 实验室用水规格3 方法原理 试样中的维生素B,(即硫胺素C,H O N,S C I)经稀酸消化、酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件F 被铁A化钾氧化生成荧光色素硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素B，的含量成正比，依此进行定量测定。4 试剂和溶液除特殊规定外.本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。4.1 盐酸溶液,0.1 m o l/I:将8.5 mL盐酸(G B 6 2 2)用水稀释至 1 0 0 0 m l。4.2 硫酸溶液，0.0 5 m o t 八:将 2.8 m L浓硫酸(G B 6 2 5)加入水中，稀释至1 0 0 0 m L o4.3 乙酸钠溶液2.0 m o t/L:取1 6 4 g 无水乙酸钠(G B 6 9 4)或2 7 2 g 结晶乙 酸钠(C H 2 0 0 0 N a 3 H,OGB 6 9 3)i f i 于水，稀释至 1 0 0 0 mL.4.4 淀粉酶悬浮液.1 0 0 g/L:用2.0 m o l/L乙酸钠溶液(4.3)悬浮1 0 g 淀粉酶制剂(T a k a d i a s t a s e，或相当活性的其他磷酸酷酶)，稀释至 1 0 0 m L，使用当日 制备。4.5 纵化钾(G B 6 4 6)溶液,2 5 0 g/L,4.6 酸性x化钾溶液:将8.5 m L浓盐酸加入至氯化钾溶液(4.5)中，并稀释至1 0 0 0 m l。4.7 氢氧化钠(G B 6 2 9)溶液，1 5 0 g/L,4.8 铁袄化钾(G B 6 4 4)溶液，1 0 g/1。4.9 碱性铁氰化钾溶液:4.0 m L的铁氰化钾溶液(4.8)与氢氧化钠溶液(4.7)混合使之成1 0 0 m L，此液4 h内使用。4.1 0 冰乙酸(G B 6 7 6)溶液，3 0 m L/L e4.1 1 人造沸石(Q/H G 1 2-4 4 5-6 3,6 0 -8 0目)使用前必需活化，方法如下:将适缝人造沸石置十大烧杯中，加入1 0 倍容积的热乙酸溶液(4.1 0)，用玻璃棒均匀搅动1 0 m i n,使沸石在乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层乙酸液。重复上 述操作两次。换用5 倍其容积的热抓化钾溶液(4.5)搅动清洗两次，每次1 5 m i n。再用热乙酸溶液洗1 0 m i n.最后用热蒸馏水清洗沸石至国家技术监督局1 9 9 3 门 1 一 0 6 批准1 9 9 4 一 0 6 一 0 1 实施G s/T 1 4 7 0 0 一 9 3无诫离子(用1 0 g 八 硝酸银水溶液检验)。用布氏漏斗抽滤,1 0 0 0 烘十，贮于磨口 瓶中备用。使用前，检查沸石对硫胺素标准溶液的回收率.如达不到9 2%,需重新活化沸石。4.1 2 硫胺素标准溶液4.1 2.1 硫胺素贮备液 I:盐酸硫胺素纯品(中国药典参照标准)，于五氧化二磷干燥器中干燥2 4 h,称取。.0 5 0 0 g,溶解于p H 3.5 -4.3 的2 0%(V/V)乙醇溶液中并定容至5 0 0 m l，盛于棕色瓶中低温保存 该溶液每毫升含。.1 m g 硫胺素。4.1 2.2 硫胺素贮备液。:取硫胺素贮备液 工(4.1 2.1)1 0 m l _ 用酸性 2 0%乙醇溶液定容至1 0 0 n i l.,盛于棕色瓶中低温保存。该溶液每毫升中含1 0 p g 硫胺素。4.1 2.3 硫胺素标准工作液:取贮备液1(4.1 2.2)2 m L与6 5 m L盐酸溶液(4.1)和5 m I乙酸钠溶液(4.3)混合，用水定容至1 0 0 m L。现用现配。该溶液每毫升中含。.2 产 9 硫胺素。4.1 3 硫酸奎宁(Q/H G 2 2-7 9 7-6 8)溶液4.1 3.1 硫酸奎宁贮备液:称取硫酸奎宁。.1 0 0 0 g，用。.0 5 m o t/L硫酸(4.2)溶解并定容i 1 0 0 0 m l.贮于棕色瓶中低温保存。若溶液混浊则需重新配制。该溶液每毫升中含0.1 m g 硫酸奎宁。4.1 3.2 硫酸奎宁工作液:取贮备液(4.1 3.1)3 m l 一用。.0 5 m o l/L硫酸定容至1 0 0 0 m l，盛于棕色瓶中，低温保存。该溶液侮毫升中含。.3 p g 硫酸奎宁。4.1 4 正丁醇(H G 3-1 0 1 2)，其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4%，否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取 1 1 4 -1 1 8 C 馏份4.1 5 无水硫酸钠(H G 3-1 2 3),5 仪器、设备5 门荧光分光光度计，备1 c m石英比色杯。5.2 电热恒温水浴。5.3 电热恒温箱5.4 实验室用样品粉碎机5.5 分析天平:感量。0 0 0 1 g e5.6 1 t 射器:1 0 m l。5.了 吸附分离柱:全长2 3 5 m m，外径X长度如下 上端贮液槽容量约为5 0 m L,3 5 m m X7 0 m m;中部吸附管8 m m X 1 3 0 m m;下端 3 5 m m拉成毛细管5.8 反应瓶:具塞离心管2 5 m l-.6 试样的制备 选取有代表性的饲料样品，至少5 0 0 g，四分法缩减至1 0 0 g，磨碎，过。2 8 m m孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。分析步骤7.1 称样:称取单索预混料 0.2 5 一。饲料、配合 饲料或浓缩饲料1-2 g(约含硫胺素4-2 0 p g)，精确至。，)0 1 g 维生5 g，精确至0.0 0 0 1 g,置于1 0 0 m L容量瓶中。C B/T 1 4 7 0 0 一9 37.2 提取7.2.1 水解:将。.1 m o l/l盐酸(4.1)6 5 mL加入试样瓶(7.1)中，经沸水浴加热 3 0 m i n，开始加热 5-1 0 m i n内不时摇动容量瓶，以防结块。或于 1 2 1-1 2 3 C 1 5 磅高压釜中加热3 0 m i n,7.2.2 酶解:冷却容量瓶至5 0 以下，加5 m L淀粉酶悬浮液(4.4),摇匀。该试液的p H约为4。4.5，将容量瓶于4 5 5 0 C 恒温箱中保温3 h，取出冷却调整p H 3.5，用水稀释至 1 0 0 m L7.2.3 过滤:将试液通过无灰滤纸过滤弃去初滤液5 m L，收集滤液于锥形瓶中。预混料提取液需逐级稀释，使之含硫胺素约为。.2 K g/m L,了.3 提纯7.3 门制备吸附柱:取 1.5 g活化人造沸石(4.1 1)置于5 0 m L小烧杯中，加入3%乙酸溶液(4.1 0)浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中(勿使吸附柱脱水)，过柱流速镇1 m L/m i n为宜。再用 1 0 m L近沸的水洗柱一次。7.3.2 吸2 5 m l提取液(7.2.3)，慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份 5 m L近沸的水洗柱三次.弃去洗液。7.13 用2 5 m l,6 0-7 0 C 酸性氯化钾(4.6)分三次连续加入吸附柱，收集洗脱液子2 5 m L容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾定容，混匀。7.3.4 同时用2 5 m L硫胺素标准工作液(4.1 2.3)。重复 7.3.1-7.3.3 操作，作为外标。7.4 氧化与萃取(以下操作避免紫外光照射)7.4-1 于两只反应管中各吸入5 m L洗脱液(7.3.3)，记作A,B,7.4.2 向B 管加3 m L氢氧化钠溶液(4.7)，再向A管中加3 m L氧化剂碱性铁氰化钾溶液(4.9)，轻轻旋摇。依次立即向A管加入1 5 m L正丁醇加塞，剧烈地振摇 1 5 s，再向B管加入1 5 m L正丁醇加塞。共同振摇 9 0 s，静置分层。7.4.3 用注射器吸去下层水相，向 各反应管加入约2 g 无水硫酸钠(4.1 5),旋摇，待测。7.4.4 同时将5 m L作为外标的洗脱液(7.3.4)，置入另两只反应管，相应地记作C,D，按 7.4.17.4.3 操作了.5 测定7.5 门用硫酸奎宁工作液(4.1 3.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件7.5.2 于激发波长3 6 5 n m，发射波长4 3 5 n m处测定各反应管中萃取液(7.4.3)和(7.4.4)的荧光强度a 分析结果的计算和表述8.1 i 一 算公式 硫胺索(维生素B)含量以m g/k g(或g/k g)表示，按下式计算:硫 胺 素(V B,m g/k g，一 兴 x c x 杂 x 会式中:7 一 一A管试液的荧光强度;叭，一一B管试液空白的荧光强度;S-一C管标准溶液的荧光强度;S,-D管标准溶液空白的荧光强度;一 一硫胺素标准工作液浓度，p g/m L;V,-一提取液总体积，m L;V,-一 分取提取液过柱的 体积，m 1,;V一 一酸 性抓 化钾洗 脱液 体积，m L;。一一 试徉质星.g 2 灼 2c B/T 1 4 7 0 0 一 9 38.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3 位9 贡复性同一分析昔 对同一试样同时或快速连续进行两次测定.所得结果之间的差值在硫胺素含量小于或等于5.0 m g/k g 时，不得超过平均值的1 5%在硫胺素含 量大于5.0 m g/k g 时，不得超过平均值的1 0%在硫胺素含量大于5 0 m g/k g 时不得超过平均值的5 X0附加说明:本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由国家饲料质检中心(北京)负责起草。本标准主要起草人陈必芳、俞巧玲、李兰、曹建民。本标准参照采用 A O A C 1 9 9 0 年版(9 4 2 2 3)测定方法。