GBT 17999.9-1999 SPF鸡间接免疫荧光试验.pdf

G B/r 1 7 9 9 9.9-1 9 9 9前言 鸡传染性贫血(C I A)，是近年来新发生的鸡病，国外均对其进行监测.C I A在我国鸡群中也有流行，因此，S P F鸡微生物学质量控制国家标准将其列入监测项目。目 前国内已建立了S P F 鸡监测C I A的通用方法一间接免疫荧光试验(I F A)，该方法已得到应用和验证，在此基础上 制定本标准 S P F鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括S P F鸡微生物学监测总则和9 种S P F鸡微生物学检测方法。本标准为 S P F鸡间接免疫荧光试验。S P F鸡微生学检测方法还包括以下部分:G B/T 1 7 9 9 9.1-1 9 9 9 S P F 鸡 红细胞凝集抑制试验;G B/T 1 7 9 9 9.2-1 9 9 9 S P F 鸡 血清中和试验;G B/T 1 7 9 9 9.3-1 9 9 9 S P F 鸡 血清平板凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.4-1 9 9 9 S P F鸡 琼脂扩散试验;G B/T 1 7 9 9 9.5-1 9 9 9 S P F鸡酶联免疫吸附试验;G B/T 1 7 9 9 9.6-1 9 9 9 S P F鸡 胚敏感试验;G B/T 1 7 9 9 9.7-1 9 9 9 S P F 鸡 鸡白 痢沙门氏菌检验;G B/T 1 7 9 9 9.8-1 9 9 9 S P F鸡 试管凝集试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由 农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位:北京市农林科学院畜牧兽医研究所、农业部实验动物研究中心。本标准主要起草人:周文平、赵立红、陈德威。中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准S P F 鸡间接免疫荧光试验G B/r 1 7 9 9 9.9 一 1 9 9 9S P F c h i c k e n-I n d i r e c t i mmu n o f l u o r e s c e n t a s s a y1 范围本标准规定了间接免疫荧光试验试剂、材料、操作程序及结果判定等本标准适用于S P F鸡感染鸡传染性贫血病毒(C h i c k e n I n f e c t i o u s A n a e m i a V i r u s,C I A V)后的抗体监测2 原理 间接免疫荧光试验，以病毒感染细胞作抗原，与待检血清中的特异抗体结合，再与荧光色素标记的抗抗体结合，形成抗原一 抗体一 抗抗体复合物。荧光色素在紫外光或蓝紫光的作用下，激发出可见的荧光因此出现荧光就说明标记物的存在，同时也反映了特异性抗体的存在。常采用已知抗原及荧光色素标记的抗抗体检测相应的抗体。3 试验和器材3.1 试剂3 门门阴性、阳性血清3.1.2 被检血清3.1.3 P B S(0.0 1 M,p H 7.2)o3.1.4 F I T C 一 免抗鸡I g G(按说明稀释使用)。11.5 缓冲甘油3.2 材料3.2.1 湿盒。3.2.2 培养箱。3.2.3 荧光显微镜。4 操作程序感染细胞的制备用MD C C-M S B-1 细胞制备鸡传染性贫血病毒感染细胞及未感染细胞(病毒培养技术参见有关文抗原片的制备 收集培养4 8 h 的细胞培养物，1 5 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n，弃上清液，用P B S 洗涤细胞沉淀物三JI、勺L车献车4.2.1次，以少量P B S重悬细胞。4.2.2 取1 0 p I 细胞悬液(含细胞1 0 个)，滴加于镀膜印孔载玻片各孔中，同时制备未感染细胞对照片。一 一 一-一 一 一 一 一 一 一国家质1E技术监督局1 9 9 9 一 1 1 一 1 0 批准2 0 0 0 一 0 4 一 0 1 实施G B/T 1 7 9 9 9.9-1 9 9 94.2.3 滴好的抗原片用热风吹干，冷丙酮(4 C)固定1 0 m i n，保存于一1 0 C，一周内使用。4.3 间接荧光抗体染色4.3.1 取出抗原片室温放置 1 0 m i n 待用4.3.2 用P B S 将灭活被检血清，阴性、阳 性血清分别稀释成I:1 0 0,1:5 0 0 两个稀释度，分别取1 0 p L滴加于抗原片各孔中。4.3.3 将加样抗原片置于湿盒内，3 7 C 孵育 3 0 m i n,4.3.4 用P B S浸洗三次，每次 1 0 m i n,4.3.5 取2 0 p L F I T C 一 兔抗鸡工 g G滴加于上 述处 理过的 抗原片各 孔中，孵育、洗 涤同 前。4.3.6 用缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察5 结果判定 C I A V感染细胞结构清晰，核内见清晰的荧光颗粒(未感染细胞中无荧光颗粒)，判为阳性。