GBT 15399-1994 饲料中含硫氨基酸测定方法离子交换色谱法.pdf

中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准饲料中含硫氨基酸测定方法 -一 离子交换色谱法G B/f 1 5 3 9 9 一 9 4De t e r mi n a t i o n o f s u l f u r -i o n e x c h a n g ea mi n o a c i d s i n f e e d s t u f f sc h r o ma t o g r a p h y1 主题内容与适用范围 本标准规定了饲料中含硫氨基酸的测定方法。本标准适用于单一饲料、配合(混合)饲料及浓缩饲料。2 引用标准 G B/T 6 4 3 2 饲料粗蛋白质测定方法 G B/T 6 4 3 9 饲料水溶氯化物测定方法3 原理 饲料中的含硫氨基酸(胧氨酸、半胧氨酸和蛋氨酸)用过甲酸氧化并经盐酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸矾，此二产物可用离子交换色谱法分离测定。4 试剂 除特别注明者外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水，电导率小于1 MS4.1 过甲酸溶液4.1.1 常规过甲 酸溶液:将3 0%过氧化氢(G B 6 6 8 4)与8 8%甲 酸(H G 3-1 2 9 6)按1:9(V/V)混合，于室温下放置1 h，置冰水浴中冷却3 0 m i n，临用前配制。4.1.2 浓缩料用过甲 酸溶液:将常规过甲 酸溶液中 按3 m g/m L加入硝酸银(G B 6 7 0)即可。此溶液适用于氯化钠含量小于3%的浓缩料。当浓缩料中氯化钠含量大于3%时，氧化剂中 硝酸银浓度可用下式计算:C,)1.4 5 4 X m X蛛 .(1)式中:C,过甲酸中硝酸银的浓度，m g/m L;C 样品中 氯化钠含量，m g/m L;。样品质量,m g,4.2 氧化终止剂4.2.1 4 8 氢澳酸(G B 6 2 1)4.2.2 偏重亚硫酸钠溶液:3 3.6 g 偏重亚硫酸钠(H G 3-9 0 9)加水定容至1 0 0 M L4.3 酸解剂国家技术监督局1 9 9 4 一 1 2 一 3 0 批准1 9 9 5 一 0 7 一 0 1 实施G B/T 1 5 3 9 9 一9 44.3.1 6.0 m o t/L盐酸溶液:将优级纯盐酸(G B 6 2 2)与水按 1:1(V/V)混合。4.3.2 6.8 m o l/L盐酸溶液:将优级纯盐酸(G B 6 2 2)1 1 3 3 m L加水稀释重2 0 0 0 m l。4.4 7.5 m o l/L氢氧化钠溶液:取优级纯氢氧化钠(G B 6 2 9)3 0 g，加水溶解并定容至1 0 0 m l-4.5 稀释上 机用柠檬酸钠缓冲液，p H 2.2,0.2 m o l/L N a:称取柠檬酸三钠(H G 3-1 2 9 8)1 9.6 g，用水溶解后加入优级纯盐酸 1 6.5 m L，硫二甘醇 5.0 m L,苯酚(H G 3-1 1 6 5)1 g，最后加水定容至1 0 0 0 m l,，用G 4 垂熔玻璃砂芯漏斗过滤。4.6 不同p H及离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液:按仪器说明书配制。4.了 荀三酮溶液:取苟三酮适量，按仪器说明书配制。4.8 磺基丙氨酸一 蛋氨酸矾标准贮备液,2.5 0 p m o l/m L:准确称取磺基丙氨酸 1 0 5.7 m g 和蛋氨酸矾1 1 3.3 m g，加水溶解并定容至2 5 0 m L.4.9 氨基酸混合标准贮备液:含有L 一 天门冬氨酸、L 一 苏氨酸等1 7 种常规蛋白质水解分析用L-A基酸，各组份浓度为2.5 0 p m o l/m l-4.1 0 混合氨基酸标准工作液:吸取磺基丙氨酸一 蛋氨酸矾标准贮备液(4.7)和氨基酸混合标准贮备液(4.8)各1.0 0 m L,置于5 0 m L容量瓶中，加稀释上机用柠檬酸钠缓冲液(4.4)定容，混匀。有关各组份浓度为5 0 n m o l/m L.5 仪器、设备5.1 实验室用样品粉碎机;5.2 样品筛:孔径0.4 5 m m(4 0目);5.3 分析夭平:感量0.0 0 0 1 g;5.4 喷灯;5.5 旋转蒸发器或浓缩器:可在室温至6 5 间调温，控温精度士1 C,真空度可低至3.3 X 1 0 P a(2 5 m m H g 柱)5.6 恒温箱或水解炉;5.7 氨基酸自 动分析仪:要求蛋氨酸A的分辨率大于9 0 0X06 样品 取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取2 5 g 左右，粉碎并过0.4 5 m m孔径(4 0 目)筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。7 分析步驻7.1 氧化和水解:称取含蛋白质7.5-2 5 m g 的试样双份(精确至0.0 0 0 1 g，样品量不超过7 5 m g),置于旋转蒸发器2 0 m L浓缩瓶或浓缩管中，于冰水浴中 冷却3 0 m i n 后加入已 经冷却的过甲 酸溶液(4.2)2 m L，加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于0 0C 冰箱中，反应1 6 h 以 下 步骤依使用不同的氧化终止剂而不同:若以氢澳酸为终止剂，于各管中加入氢澳酸(4.1)0.3 m L，振摇，放回冰浴，静置3 0 m i n，然后移到旋转蒸发器或浓缩器(5.5)上，在6 0 C、低于3.3 X 1 0 P a(2 5 m m H g 柱)下浓缩至干。用盐酸溶液(4.3.1)约1 5 m L将残渣定量转移到2 0 m L安瓶中，封口，置恒温箱中、1 1。士1 C 下水解2 2 2 4 h也可用6.0 m o l/I 盐酸溶液约2 5 m l将残渣转移到5 0 m L消煮管中，于水解炉中、1 1。士3 下回流水解2 2-2 4 h.取出安瓶或水解管，冷却，用水将内容物定量地转移至5 0 m L容量瓶中，定容。充分混匀，过滤，取1-2 m L滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中，在低于5 0 的条件下，减压蒸发至千。加少许水重复蒸干2-3 次准确加入一定体积(2 -5 m L)的稀释上机用柠檬酸钠缓冲液(4.5)振摇，充分溶解后离心，取上清G B/T 1 5 3 9 9 一 9 4液供仪器测定用 若以偏重亚硫酸钠为终止剂，则于样品氧化液中加入偏重亚硫酸钠溶液(4.2.2)0.5 m l，充 分摇匀后，直接加人盐酸溶液(4.3.2)1 7.5 m L,置1 1 0 士3 C 水解2 2 -2 4 h.取出 水解管，冷却，用水将内 容物转移到5 0 m L 容量瓶中，用氢氧化钠溶液(4.4)中和至p H约2.2,并用稀释上机用缓冲液(4.5)定容，离心，取上清液供仪器测定用。如氨基酸分析受上机样品液中N a 十 浓度影响，色谱峰出峰时间漂移过大，则需先将水解液定容过滤，而后取 2 -5 mL滤液，于 5 0 下，减压蒸发至约。.5 mL(切勿蒸干)，用稀释上机用缓冲液(4.5)将其转移至1 0 m L容量瓶中，加氢氧化钠溶液(4.4)调至p H 2.2，并用稀释上机用缓冲液(4.5)定容。混匀，离心，取上清液供仪器测定用。浓缩料测定首先按G B 6 4 3 9 测定其N a C l 含量。样品处理步骤同上，只是氧化剂使用4.1.2.7.2 测定:用混合氨基酸标准工作液(4.9)，按仪器说明书，调整仪器的操作参数和(或)洗脱用柠檬酸缓冲液(4.5)的p H，使蛋氨酸矾分辨率达最佳状态(大于或等于 9 0 0 0)，注入制备好的样品和氨基酸标准工作液(4.9)，进行分析测定。每5 个样品(即 1 0 个单样)为一组，组间插入混合氨基酸标准工作液(4.9)进行校准。8 分析结果的表述分析结果表示为肤氨酸和蛋氨酸在样品中的质量百分率，计算公式如下 沐A-m胧(蛋)氨酸(%)=t o-s x D x l o o (2)式中:A-每毫升上机样品液中胧(蛋)氨酸的含量,n g;m 样品质量,m g;D 样品稀释倍数。以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。9 重复性两个平行样品测定值的相对偏差，当肤(蛋)氨酸的含量小于。.5 0%时，不大于 5%;大于。.5 0%时，不大于 4%.附加说明:本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由中国农业科学院分析测试中心 兼国家饲料质量监督检验中心(北京)、中国农业科学院畜牧研究所和吉林省农业科学院大豆研究所共同起草。本标准主要起草人常碧影、李建凡、张明、闺惠文、左江湾。