GBT 13110-1991 蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定方法.pdf

中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准 蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定方法蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定方法 GB/T 13110-91 Method for determination of tetracyclines residue in honey 1 主题内容与适用范围 主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物管碟法测定蜂蜜中四环素族抗生素残留量的方法。本标准规定了用微生物管碟法测定蜂蜜中四环素族抗生素残留量的方法。本标准适用于天然或加工蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定。本标准适用于天然或加工蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定。2 原理 原理 样品中四环素族抗生素经 样品中四环素族抗生素经 Mcllvaine 缓冲液提取后缓冲液提取后,用用 SEP-PAK C18 柱纯化。四环素族三柱纯化。四环素族三 种抗生素四环素、土霉素及金霉素利用薄层层析生物检测法进行分离和定性；以蜡样芽胞种抗生素四环素、土霉素及金霉素利用薄层层析生物检测法进行分离和定性；以蜡样芽胞 杆菌为试验菌株杆菌为试验菌株,用微生物管碟法进行定量检测。用微生物管碟法进行定量检测。3 试剂 试剂 所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3.1 Mcllvaine 缓冲液缓冲液(pH 4)：称取磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)27.6g、柠檬酸、柠檬酸(C6H8O7 H2O)12.9g、乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸二钠盐 37.2g，用水溶解后稀释并定容至，用水溶解后稀释并定容至 1000mL。3.2 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pH4.5)：称取磷酸氢二钾：称取磷酸氢二钾 13.6g,用水溶解后稀释并定容至用水溶解后稀释并定容至 1000 mL,115灭菌灭菌 30 min，置，置 4冰箱中保存。冰箱中保存。3.3 5%乙二胺四乙酸二钠盐水溶液。乙二胺四乙酸二钠盐水溶液。3.4 Waters SEP-PAK C18柱柱(或国产或国产PT-C18柱柱)：用时先经：用时先经10mL甲醇滤过活化甲醇滤过活化,再用再用10mL蒸蒸 馏水置换，然后用馏水置换，然后用 10mL 5%乙二胺四乙酸二钠盐流过。乙二胺四乙酸二钠盐流过。3.5 标准抗生素：四环素、土霉素，金霉素标准品由卫生部药品生物制品检定所提供。标准抗生素：四环素、土霉素，金霉素标准品由卫生部药品生物制品检定所提供。3.6 抗生素标准原液和稀释液 抗生素标准原液和稀释液 3.6.1 抗生素标准原液配制：精确称取四环素，土霉素、金霉素标准品适量 抗生素标准原液配制：精确称取四环素，土霉素、金霉素标准品适量(按效价进行按效价进行 换算换算)，用，用 0.01 mol/L 盐酸溶解并定容至盐酸溶解并定容至 1000g/mL，置，置 4冰箱中冰箱中(可使用可使用 7 天天)。3.6.2 抗生素标准稀释液配制：临用前取上述原液按 抗生素标准稀释液配制：临用前取上述原液按 1:0.8 剂距用剂距用 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 逐步稀释配制成标准稀释液。制备四环素、土霉素标准曲线的标准浓度为逐步稀释配制成标准稀释液。制备四环素、土霉素标准曲线的标准浓度为 0.16,0.21,0.26 0.32,0.40,0.50g/mL,参考浓度为参考浓度为 0.25g/mL；制备金霉素标准曲线的标准浓度为；制备金霉素标准曲线的标准浓度为 0.033 0.041,0.051,0.064,0.08,0.10g/mL,参考浓度为参考浓度为 0.05g/mL。定性试验用标准液浓度四。定性试验用标准液浓度四 环素，土霉素为环素，土霉素为 2g/mL，金霉素为，金霉素为 1g/mL。3.7 展开剂：正丁醇 展开剂：正丁醇-醋酸醋酸-水水(4：1：5)。4 仪器 仪器 4.1 隔水式恒温箱。隔水式恒温箱。4.2 冰箱 冰箱:04。4.3 恒温水浴。恒温水浴。4.4 高压灭菌器。高压灭菌器。4.5 旋转式减压蒸馏器。旋转式减压蒸馏器。4.6 离心机：离心机：2000r/min。4.7 天平：感量 天平：感量 0.1mg。4.8 层析缸：内长 层析缸：内长 20cm、宽、宽 15cm、高、高 30cm。4.9 长方形培养皿：长方形培养皿：1.5cm8cm23cm。4.10 层析纸：层析纸：7cm22cm，中速滤纸。，中速滤纸。4.11 微量注射器：微量注射器：10L、50L。4.12 电吹风机。电吹风机。4.13 游标卡尺。游标卡尺。4.14 吸管：容量为吸管：容量为 1mL 和和 10mL，标有，标有 0.1mL 单位刻度。单位刻度。4.15 注射器：容量为注射器：容量为 20mL。4.16 平皿：内径为平皿：内径为 90mm，高，高 1617mm，底部平整光滑，具陶瓷盖。，底部平整光滑，具陶瓷盖。4.17 不锈钢小管不锈钢小管(简称小管简称小管)：内径：内径 6.00.1mm，外径，外径 7.80.1mm，高度，高度 100.1mm。5 培养基 培养基 5.1 菌种培养基：菌种培养基：胰蛋白胨胰蛋白胨 10.0g；牛肉浸膏 牛肉浸膏 5.0g;氯化钠 氯化钠 2.5g;琼脂琼脂 1416g;蒸馏水蒸馏水 1000mL。将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，110灭菌灭菌 30min，最终，最终 pH 值为值为7.2 7.4。5.2 检定用培养基：检定用培养基：胰蛋白胨 胰蛋白胨 5.0g；牛肉浸膏 牛肉浸膏 3.0g；磷酸氢二钾 磷酸氢二钾 3.0g；琼脂 琼脂 1416g；蒸馏水 蒸馏水 1000 mL。将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，将上述各成分混合于蒸馏水中，搅拌加热至溶解，110灭菌灭菌 30min，最终，最终 pH 值为值为 6.50.1。6 试样处理 试样处理 6.1 定量试验用样液制备：称取混匀的蜂蜜样品 定量试验用样液制备：称取混匀的蜂蜜样品 10.0g，加入，加入 30mL pH4.0 的的 Mcllvaine 缓缓 冲液，搅拌均匀，待溶解后进行过滤，滤液分数次置于注射器中，用经预处理的冲液，搅拌均匀，待溶解后进行过滤，滤液分数次置于注射器中，用经预处理的 SEP-PAK C18 柱滤过，用柱滤过，用 50mL 水洗柱，再用水洗柱，再用 10mL 甲醇洗脱，洗脱液经甲醇洗脱，洗脱液经 40减压浓缩蒸干后，准确加减压浓缩蒸干后，准确加 入入 PH4.5 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 34mL 溶解，备定量检测用。溶解，备定量检测用。6.2 定性试验用样液制备：称取蜂蜜样品 定性试验用样液制备：称取蜂蜜样品 5g,按按 6.1 步骤处理，甲醇洗脱液经步骤处理，甲醇洗脱液经 40减压浓减压浓 缩蒸干后，用缩蒸干后，用 0.1mL 甲醇溶解，备定性试验用。甲醇溶解，备定性试验用。7 菌液和检定用平板的制备 菌液和检定用平板的制备 7.1 试验菌种：蜡样芽胞杆菌 试验菌种：蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus var.mycoides)，菌号，菌号 63301，由卫生部，由卫生部 药品生物制品检定所提供。药品生物制品检定所提供。7.2 菌液的制备：将菌种移种于盛有菌种用培养基的克氏瓶内，于 菌液的制备：将菌种移种于盛有菌种用培养基的克氏瓶内，于 37培养培养 7 天，使镜检天，使镜检 芽胞数达芽胞数达 85%，先用，先用 10mL 灭菌水洗下菌苔，离心灭菌水洗下菌苔，离心 20min，弃去上清液，重复操作一次，再加，弃去上清液，重复操作一次，再加 10mL 灭菌水于沉淀物中，混匀。然后，将此芽胞悬浮液置灭菌水于沉淀物中，混匀。然后，将此芽胞悬浮液置 65恒温水浴中加热恒温水浴中加热 30min，从，从 水浴中取出水浴中取出,于室温下放置于室温下放置 24h，再于，再于 65恒温水浴中加热恒温水浴中加热 30min，待冷后置，待冷后置 4冰箱保存。冰箱保存。用时可取此芽胞悬液以灭菌水稀释用时可取此芽胞悬液以灭菌水稀释 10 倍成稀菌液。倍成稀菌液。7.3 芽胞悬液用量的测定：芽胞悬液用量的测定：把不同量的稀菌液加入检定用培养基中把不同量的稀菌液加入检定用培养基中,按本法进行操作，按本法进行操作，0.25 g/mL 的四环素参考浓度可产生的四环素参考浓度可产生 15mm 以上的清晰、完整的抑菌圈，选择出最适宜的以上的清晰、完整的抑菌圈，选择出最适宜的 芽胞悬液用量。一般为每芽胞悬液用量。一般为每 100mL 检定用培养基加入检定用培养基加入 0.20.5mL 稀菌液。稀菌液。7.4 检定用平板的制备：试验用平皿内预先铺有 检定用平板的制备：试验用平皿内预先铺有 20mL 检定培养基作为底层，将适量稀检定培养基作为底层，将适量稀 菌液菌液(已于已于 7.3 中确定中确定)加到溶化后冷却至加到溶化后冷却至 5560的检定用培养基中，混匀后往上述平的检定用培养基中，混匀后往上述平 皿内加入皿内加入 5mL 作为菌层。前后摇动平皿，使菌层均匀覆盖于底层表面，置水平位置上，作为菌层。前后摇动平皿，使菌层均匀覆盖于底层表面，置水平位置上，盖上陶瓷盖，待凝固后，每个平板的培养基表面放置盖上陶瓷盖，待凝固后，每个平板的培养基表面放置 6 个小管，使小管在半径个小管，使小管在半径 2.3cm 的圆的圆 面上成面上成 60角的间距。所用平板须当天准备。角的间距。所用平板须当天准备。8 定量试验 定量试验 8.1 标准曲线的制备：取 标准曲线的制备：取 3 个检定用平板为一组，个检定用平板为一组，6 个标准浓度需要六组，在该组每个检个标准浓度需要六组，在该组每个检 定用平板的定用平板的 3 个间隔小管内注满一参考浓度液，在另个间隔小管内注满一参考浓度液，在另 3 个小管内注满一标准浓度液，于个小管内注满一标准浓度液，于 37 1培养培养 16h，然后测量参考浓度和标准浓度的抑菌圈直径，求得各自，然后测量参考浓度和标准浓度的抑菌圈直径，求得各自 9 个数值的平均值个数值的平均值,并并 计算出各组内标准浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值计算出各组内标准浓度与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值 F，以标准浓度，以标准浓度 C 为纵坐标，以为纵坐标，以 相应的相应的 F 值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。8.2 样品测定：每份样品取样品测定：每份样品取3个检定用平板个检定用平板,在每个平板上在每个平板上3个间隔的小管内注满个间隔的小管内注满0.25g/mL 四环素参考浓度四环素参考浓度(或或 0.25g/mL 土霉素或土霉素或 0.05g/mL 金霉素，视所含抗生素种类而定金霉素，视所含抗生素种类而定),另另 3个个 小管内注满被检样液，于小管内注满被检样液，于 371培养培养 16h，测量参考浓度和被检样液的抑菌圈直径，求得，测量参考浓度和被检样液的抑菌圈直径，求得 各自各自 9 个数值的平均值，并计算出被检样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值个数值的平均值，并计算出被检样液与参考浓度抑菌圈直径平均值的差值 Ft。9 定性试验 定性试验 取层析用滤纸 取层析用滤纸(7cm22cm)均匀喷上均匀喷上 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pH4.5)，于空气中晾，于空气中晾 干、备用。在距滤纸底边干、备用。在距滤纸底边 2.5cm 起始线上起始线上,分别滴加分别滴加 10L 2g/mL 四环素、土霉素及四环素、土霉素及 1g/mL 金霉素标准稀释液与定性试验样液，将滤纸挂于盛有展开剂金霉素标准稀释液与定性试验样液，将滤纸挂于盛有展开剂(3.7)的层析缸中，以上行法的层析缸中，以上行法 展开，待溶剂前沿展至展开，待溶剂前沿展至 15cm 处将滤纸取出，于空气中晾干，贴在事先加有处将滤纸取出，于空气中晾干，贴在事先加有 60mL 含有试验用含有试验用 菌菌层的长方形培养皿上菌菌层的长方形培养皿上,30min 后移去滤纸，在后移去滤纸，在 371培养培养