SNT 5361-2021 出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法 fusA基因测序法.pdf

I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX 0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 6 12 0 2 1 出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法f u s A基因测序法D e t e c t i o n o f C r o n o b a c t e r s a k a z a k i i i n e x p o r t f o o d f u s A g e n e s e q u e n c i n g m e t h o d2 0 2 1-1 1-2 2发布2 0 2 2-0 6-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法f u s A基因测序法S N/T 5 3 6 12 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 0 9网址 w ww.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0.5 字数1 5千字2 0 2 2年6月第一版 2 0 2 2年6月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 57 3 0 定价8.0 0元以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心。本文件主要起草人:汪琦、曾静、徐蕾蕊、付溥博、赵晓娟、李丹、马丹、魏海燕、王紫薇、张西萌。S N/T5 3 6 12 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法f u s A基因测序法1 范围本文件规定了出口食品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法。本文件适用于出口食品中阪崎克罗诺杆菌(C r o n o b a c t e r s a k a z a k i i)的检测。本文件也 适 用 于 出 口 食 品 中 克 罗 诺 杆 菌 属 其 他 六 个 种,分 别 为 丙 二 酸 盐 阳 性 克 罗 诺 杆 菌(C r o n o b a c t e r m a l o n a t i c u s)、苏 黎 世 克 罗 诺 杆 菌(C r o n o b a c t e r t u r i c e n s i s)、穆 汀 斯 克 罗 诺 杆 菌(C r o n o b a c t e r m u y t j e n s i i)、都 柏 林 克 罗 诺 杆 菌(C r o n o b a c t e r d u b l i n e n s i s)、尤 尼 沃 斯 克 罗 诺 杆 菌(C r o n o b a c t e r u n i v e r s a l i s)和康帝蒙提克罗诺杆菌(C r o n o b a c t e r c o n d i m e n t i)的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.4 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B 1 9 4 8 9 实验室生物安全通用要求 G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 管家基因 h o u s ek e e p i n g g e n e其是所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。其又称看家基因,持家基因。3.2 T a q D N A酶 T h e r m u s a q u a t i c u s D N A p o l y m e r a s e其是从T h e r m u s a q u a t i c u s细菌中提取的耐热D NA聚合酶。3.3 多位点序列分型 m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g其是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通过P C R扩增多个管家基因内部片段并测定其序列以分析菌株的差异。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。B H I:脑心浸出液肉汤(b r a i n h e a r t i n f u s i o n b r o t h);D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d);d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(d e o x y-r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e);E D T A:乙二胺四乙酸(e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d);1S N/T5 3 6 12 0 2 1以正式出版文本为准 f u s A:延长因子G基因(e l o n g a t i o n f a c t o r G);G T P:三磷酸鸟苷(g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e);ML S T:多位点序列分型(m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g);P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)。5 原理 f u s A基因是细菌延长因子的编码基因。在克罗诺杆菌属细菌中负责编码延长因子G,该因子在翻译延长过程中催化G T P依赖的核糖体的转运。f u s A基因是克罗诺杆菌属ML S T分型使用的七个管家基因之一,其基因的序列对克罗诺杆菌属的分类效果好,相同的f u s A基因序列基本不会同时存在于两种克罗诺杆菌中。因此,可利用该基因片段的序列信息区分克罗诺杆菌属的不同种。6 试剂和材料 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合G B/T 6 6 8 2中一级水的要求。所有试剂均用无D NA酶污染的容器分装。6.1 E x T a q D NA聚合酶。6.2 d NT P:d AT P、d T T P、d C T P、d G T P。6.3 D NA提取试剂:D NA提取试剂盒。6.4 1 0E x T a q 缓中液。6.5 M g C l2溶液(2 5 mm o l/L)。6.6 T E缓冲液:1 0 mm o l/L T r i s-HC l(p H 8.0),1 mm o l/L E D T A(p H 8.0)。6.7 琼脂糖。6.8 5 0T A E缓冲液:2 m o l/L T r i s-HC l(p H 8.4),1 m o l/L 乙酸,0.1 m o l/L E D T A。6.9 D NA分子量标记物(1 0 0 b p 2 0 0 0 b p)。6.1 0 参考菌株:阪崎克罗诺杆菌 AT C C 2 9 5 4 4。7 仪器和设备7.1 P C R扩增仪。7.2 电泳仪。7.3 凝胶成像系统。7.4 离心机:离心力不小于1 2 0 0 0 g。7.5 恒温培养箱:3 6 1。7.6 恒温水浴锅:4 4 0.5 。7.7 微量移液器和无菌吸头:1 0 L、1 0 0 L、2 0 0 L、1 0 0 0 L。7.8 天平:感量为0.1 g。7.9 灭菌三角烧瓶:5 0 0 m L、2 5 0 m L。7.1 0 灭菌平皿:9 0 mm1 5 mm。7.1 1 无菌离心管:1.5 m L、2 0 0 L。2S N/T5 3 6 12 0 2 1以正式出版文本为准8 检测步骤8.1 样品制备、增菌培养和分离 样品的制备、增菌培养和分离步骤参照G B 4 7 8 9.4 0的方法进行。8.2 模板D N A的制备 取分离菌株B H I液体培养物适量,加到1.5 m L无菌离心管中,1 3 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,吸弃上清,加5 0 L T E缓冲液,混匀后沸水浴1 0 m i n,1 3 0 0 0 r/m i n离心5 m i n,上清液用于后续实验。也可使用商业化的D NA提取试剂盒,并按其说明制备模板D NA。8.3 P C R反应体系8.3.1 P C R扩增和测序引物序列 扩增正向引物:5-GAA A C C G T A T G G C G T C AG-3;扩增反向引物:5-AGA A C C GAA G T G C AG A C G-3;测序正向引物:5-G C T G GA T G C G G T AAT T GA-3;测序反向引物:5-C C C AT A C C A G C G AT G AT G-3。8.3.2 P C R反应体系 见表1。表1 P C R反应体系试剂贮备液浓度加样体积/L终浓度双蒸水补至5 0 L1 0P C R缓冲液5.01M g C l22 5 mm o l/L3.01.5 mm o l/Ld N T P2.5 mm o l/L e a c h4.00.2 mm o l/L e a c h上游引物1 0 p m o l/L2.00.4 p m o l/L下游引物1 0 p m o l/L2.00.4 p m o l/LT a q酶5 U/L0.50.0 5 U/L模板D NA2.0 注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。8.3.3 反应条件 9 6 预变性1 m i n;9 6 变性1 m i n,5 8 退火1 m i n,7 2 延伸2 m i n,3 0个循环;7 2 延伸5 m i n;4 保存反应产物。注:P C R反应参数也可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为阪崎克罗诺杆菌参考菌株AT C C 2 9 5 4 4的基因组D NA,空白对照为无菌水。S N/T5 3 6 12 0 2 1以正式出版文本为准