SNT 5334.6-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第6部分：转基因马铃薯.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5334.62020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法第 6 部分：转基因马铃薯Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived productsPart 6:Genetically modified potato2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020.01CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布SN/T 5334.62020前 言SN/T 53342020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法分为 8 个部分：第 1 部分：通用要求及定义；第 2 部分：转基因大豆；第 3 部分：转基因玉米；第 4 部分：转基因油菜；第 5 部分：转基因棉花；第 6 部分：转基因马铃薯；第 7 部分：转基因苜蓿；第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 53342020 的第 6 部分。本文件按照 GB/T1.12020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国青岛海关技术中心，中华人民共和国大连海关技术中心、中华人民共和国沈阳海关技术中心。本文件主要起草人：孙敏，高宏伟，郑秋月，肖西志，崔淑华，付伟，朱水芳，徐洋，孙雯娴，孙明君，陈盛盛，曹际娟。I1SN/T 5334.62020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 6 部分：转基因马铃薯1 范围本文件规定了进、出口马铃薯中转基因品系 AV43 特异性的数字 PCR（dPCR）定量检测方法。本文件适用于马铃薯中转基因马铃薯 AV43 品系特异性的成分定量检测。本文件检测限参见附录 A。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义3 术语和定义SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。4 方法原理见 SN/T 5334.1。5 主要设备及试剂5.1 内源基因和外源基因：内源基因为马铃薯 蔗糖转化酶（fru:）；外源序列为转基因马铃薯 AV43品系外源基因 5 端与马铃薯内源基因组结合区间。引物及探针序列参见附录 A。5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。6 方法操作步骤6.1 一般性操作步骤一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。6.2 数字 PCR 反应体系数字 PCR 反应体系配制见表 1。2SN/T 5334.62020表 1 数字 PCR 反应体系试剂体积终浓度内参基因扩增体系（25 L）2ddPCR Super Mix12.51内参基因上游引物（10 mol/L）1200 nmol/L内参基因下游引物（10 mol/L）1200 nmol/L内参基因探针（10 mol/L）1200 nmol/L20 ng/L DNA 模板54 ng/L水补足至 25 L 反应体系外源基因扩增体系（25 L）2ddPCR Super Mix12.51品系上游引物（10 mol/L）1200 nmol/L品系下游引物（10 mol/L）1200 nmol/L品系探针（10 mol/L）1200 nmol/L20ng/L DNA 模板54 ng/L水补足至 25 L 反应体系 注：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验。6.3 数字 PCR 反应程序6.3.1 数字 PCR 反应程序见表 2。表 2 数字 PCR 反应程序反应温度反应时间循环数热启动a50 2 min195 3 min热循环（扩增）b95 15 s5060 30 s a：根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增）步骤。b：根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，后处理步骤按照不同数字 PCR 平台说明书进行。6.3.2 其他要求见 SN/T 5334.1。7 结果判定与表述结果表述如下：检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出马铃薯内源基因 fru，表述为“未检出马铃薯成分”；3SN/T 5334.62020 检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说明检出马铃薯内源基因 fru，但未检出 XXX 品系特异性序列，表述为“未检出马铃薯 XXX转基因品系”；检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该转基因品系 XXX 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出马铃薯 XXX 转基因品系，含量为 XX%”。8 防污染措施防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。9 样品保存样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。4SN/T 5334.62020附 录 A（资料性附录）引物探针序列、反应程序以及检测限表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限基因/品系名称序列（5-3）终浓度/nmol/L退火温度（Tm）定性检测限定量检测限fru上游引物CTGCCTCCGTCAAGATTTGGTCACT200601.258下游引物CTCTTCCCTTTCTTGATGG200探针FAM-ACTTGTAATTCATCAAGCCAT-BHQ1200AV43上游引物GGTATCAGGTTCTGGAATAAGACCAA20060下游引物TGTCGTGCCAGCTGCATTA200探针FAM-CCCGCGCGTTGGCCGAT-BHQ1200中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 8801230 1/16 印张 0.5 字数 14 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1000书号：000000 定价 14.00 元转基因植物产品的数字PCR检测方法第6部分：转基因马铃薯行 业 标 准SN/T 5334.62020*网址 5334.62020