SNT 5074-2018 出口食品中二甲基黄的测定 液相色谱-质谱质谱法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 50742018出口食品中二甲基黄的测定液相色谱-质谱/质谱法Determination of dimethyl yellow in foods for exportLC-MS/MS Method2018-03-12 发布2018-10-01 实施ICS 67.050X 04中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 43 千字2021 年 3 月第一版 2021 年 3 月第一次印刷印数 110书号：155175523 定价 21.00 元出口食品中二甲基黄的测定液相色谱-质谱/质谱法行 业 标 准SN/T50742018*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7530北京中献拓方科技发展有限公司印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址 50742018I前 言本标准按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国霍尔果斯出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李优、赖国银、孟令华、盛永刚、曹晨、曲栗、丁涛、徐敦明、伊雄海、邓晓军、郭德华、李志威。1SN/T 50742018出口食品中二甲基黄的测定 液相色谱-质谱/质谱法1 范围本标准规定了出口食品中二甲基黄的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于腐乳、豆干、辣椒酱、熟制禽蛋和火腿等含油脂食品中二甲基黄的测定和确证。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要试样加水超声水浴，乙酸乙酯提取，N-丙基乙二胺-混合型强阳离子交换混合固相萃取柱净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，内标法定量。4 试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T6682 规定的一级水。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 氨水。4.3 乙腈：色谱纯。4.4 乙酸乙酯：色谱纯。4.5 氯化钠。4.6 乙酸铵。4.7 甲酸，纯度 99%。4.8 10%氨水-甲醇溶液：量取 100mL 氨水，用甲醇定容至 1L。4.9 5mmol/L 乙酸铵（含 0.1%甲酸）溶液：称取 0.385g 乙酸铵溶解于适量水中，加入 1mL 甲酸，用水定容至 1L。4.10 0.1%甲酸乙腈溶液：量取 1mL 甲酸，用乙腈定容至 1L。4.11 二甲基黄标准物质N,N-二甲基-4-（苯偶氮基）苯胺：C14H15N3，CAS 号 60-11-7，相对分子质量 225.29，纯度 98。4.12 二甲基黄标准储备液：准确称取二甲基黄标准品 10mg（精确至 0.1mg），于 100mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成浓度为 100g/mL 的溶液，于-18储存，有效期 12 个月。4.13 二甲基黄标准中间液：准确吸取二甲基黄标准储备液 1mL 至 10mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为 10g/mL 的溶液，于 4储存，有效期 12 个月。4.14 二甲基黄标准工作液：临用时准确吸取二甲基黄标准中间液 1mL 至 10mL 容量瓶中，用乙腈2SN/T 50742018定容至刻度，配成浓度为 1g/mL 的溶液，现用现配。4.15 D5-二甲基黄内标标准物质D5-N,N-二甲基-4-（苯偶氮基）苯胺:C14H10D5N3，CAS 号1398109-08-4，相对分子质量 230.32，纯度 99。4.16 D5-二甲基黄内标储备液：准确称取 D5-二甲基黄内标标准品10.0mg（精确至 0.1mg）于100mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成浓度为 100g/mL 的溶液，于-18储存，有效期为 12 个月。4.17 D5-二甲基黄内标中间液：准确吸取二甲基黄标准储备液 1mL 至 10mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为 10g/mL 的溶液，于 4储存，有效期 12 个月。4.18 D5-二甲基黄内标工作液：临用时准确吸取 D5-二甲基黄内标中间液 1mL 至 10mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成浓度为 1g/mL 的溶液，现用现配。4.19 固相萃取柱：N-丙基乙二胺（PSA）-强阳离子交换（SCX）混合，3mL，300mg，或相当者，使用前用 3mL 乙酸乙酯活化。4.20 微孔滤膜：0.22m，尼龙针式过滤器。5 仪器和设备5.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。5.2 固相萃取装置。5.3 电子天平：感量分别为 0.001g，0.0001g。5.4 离心机：最大转速为 5000r/min。5.5 离心管：15mL，50mL。5.6 涡旋混匀器。5.7 氮吹仪。5.8 超声波水浴。6 试样制备与保存6.1 腐乳、辣椒酱取代表性样品约 500g，充分混匀，分成两份，分别装入洁净的容器中，密封并标识，将试样置于-18以下保存。6.2 豆干、熟制禽蛋、火腿取代表性样品约 500g，用粉碎机捣碎并混合混匀，分成两份，分别装入洁净的容器中，密封并标识，将试样置于-18下保存。7 测定步骤7.1 提取称取约 1g 试样（精确至 0.01g）于 50mL 离心管中，加入 50LD5-二甲基黄内标工作液（4.18），加入 2mL 水，超声水浴 10min，加入 1g 氯化钠（4.5）和 10mL 乙酸乙酯（4.4），涡旋混合 5min，以 4000r/min 的速度离心 5min。吸取 2.5mL 上层清液至 15mL 离心管中，待净化。3SN/T 507420187.2 净化将待净化液转移至固相萃取柱（4.19）中，用 3mL 乙酸乙酯（4.4）以 1mL/min 的流速淋洗，弃去淋出液，于负压下抽干固相萃取柱，用 5mL10%氨水-甲醇以 1mL/min 的流速洗脱于 15mL 离心管中。洗脱液于 40下氮吹至干，加入 1.00mL 乙腈（4.3）超声振荡溶解，过 0.22m 滤膜，供LC-MS/MS 测定。7.3 标准曲线溶液的配制临用时准确吸取二甲基黄标准工作液（4.14）25L、50L、125L、250L、500L，D5-二甲基黄内标工作液（4.18）125L 至 10mL 容量瓶中，用乙腈（4.3）定容至刻度，配成二甲基黄浓度为2.5ng/mL、5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL，D5-二甲基黄浓度为 12.5ng/mL 的溶液，现用现配。7.4 测定7.4.1 液相色谱条件7.4.1.1 色谱柱：C18，长 50mm，内径 4.6mm，粒径 1.8m，或相当者。7.4.1.2 柱温：25。7.4.1.3 流动相：A，5mol/L 乙酸铵（含 0.1%甲酸）；B，0.1甲酸乙腈，流动相梯度洗脱程序见表 1。7.4.1.4 流速：0.40mL/min。7.4.1.5 进样量：10L。表 1 流动相梯度洗脱程序时间/min流动相 A/%5mol/L 乙酸铵（含 0.1%甲酸）流动相 B/%0.1%甲酸乙腈0.080202.080204.0208014.0208014.1802016.580207.4.2 质谱条件7.4.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）。7.4.2.2 扫描方式：正离子扫描。7.4.2.3 检测方式：多反应监测模式（MRM）。7.4.2.4 雾化气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去集族电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度，参考质谱参数参见附录 A。7.4.2.5 定性离子对、定量离子对参见附录 A 表 A.1。4SN/T 507420187.4.3 液相色谱-质谱/质谱测定7.4.3.1 定性测定按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准曲线溶液，如果检测的质量色谱峰的保留时间与标准品保留时间相差不超过 5，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且定性离子对的相对丰度（用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度允许偏差不超过表 2 规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表 2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%502050102010允许的最大偏差/%202530507.4.3.2 定量测定在仪器最佳工作条件下，对标准曲线溶液进样。以二甲基黄和 D5-二甲基黄的浓度比为横坐标，以二甲基黄和 D5-二甲基黄的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线进行定量。样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下二甲基黄标准品多反应监测（MRM）色谱图参见附录 B 图 B.1。7.4.4 空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。8 结果计算和表述试样中二甲基黄的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得，计算结果需扣除空白值：cV1000m1000X=（1）式中：X 试样中二甲基黄的含量，单位为微克每千克（g/kg）；c 从标准工作曲线得到的二甲基黄浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m 最终定容体积试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）。9 定量限和回收率9.1 定量限本方法的定量限为 10g/kg。9.2 回收率采用本方法对腐乳、豆干、辣椒酱、熟制禽蛋和火腿 5 种食品基质进行添加回收试验，不同添加浓度范围内二甲基黄的回收率资料参见附录 C 表 C.1。5SN/T 50742018附录 A（资料性附录）质谱参考条件1）质谱参考条件：a）电离源模式：电喷雾离子源；b）电离源极性：正模式；c）检测方式：多反应监测；d）雾化气：氮气；e）雾化气压力：0.344MPa（50psi）；f）毛细管电压：4000V；g）干燥气温度：350；h）干燥气流速：10L/min；i）分辨率：单位分辨率；j）定量离子对、定性离子对、碎裂电压（V）、碰撞能量（eV），见表 A.1。表 A.1 二甲基黄定量离子对、定性离子对、碎裂电压、碰撞能量化合物检测模式保留时间/min定量离子对/（m/z）定性离子对/（m/z）碎裂电压/（V）碰撞能量/（V）二甲基黄正模式10.58225.5/76.9226.3/76.912540226.3/120.012530D5-二甲基黄正模式10.50230.5/82.0230.5/82.012540230.5/120.0125301）非商业性声明：附录 A 所列参考质谱条件是在 Agilent6410 型液质联用仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。6SN/T 50742018附录 B（资料性附录）二甲基黄和 D5-二甲基黄的标准物质多反应监测（MRM）色谱图a）b）c）图 B.1 2.5 ng/mL 二甲基黄和 12.5 ng/mL D5-二甲基黄标准品多反应监测（MRM）色谱图7SN/T 50742018附录 C（资料性附录）二甲基黄在腐乳、辣椒酱、豆干、熟制禽蛋和火腿中的回收率范围表 C.1 二甲基黄在腐乳、辣椒酱、豆干、熟制禽蛋和火腿中的回收率范围测定物质添加水平/（g/kg）回收率范围/%腐乳辣椒酱豆干熟制禽蛋火腿二甲基黄10.090.199.286.095.590.399.092.6100.192.0102.420.094.599.590.599.590.599.094.5102.091.6103.