SNT 5090.1-2018 商品化试剂盒检测方法 霉菌和酵母菌 方法一.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5090.12018商品化试剂盒检测方法 霉菌和酵母菌方法一Commercial Kit MethodMold and Yeast Test Method I2018-03-12 发布2018-10-01 实施ICS 00.000C 00中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布SN/T 00002019I前 言SN/T 5090商品化试剂盒检测方法霉菌和酵母菌共分为 2 部分：第 1 部分：方法一；第 2 部分：方法二。本部分为 SN/T 5090 系列标准的第 1 部分。本部分按照 GB/T 1200 给出的规则起草。本部分代替 SN/T 25602010食品中霉菌和酵母菌的计数 PetrifilmTM 测试片法。本部分与 SN/T 25662010 相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称；修改了附录 A；增加了计算公式；增加了附录 B；本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局大连启元科技发展有限公司。本部分起草人：刘淑艳颜怀玉丁健孙晓飞蒋丹周振亚本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 25662010。1SN/T 00002019商品化试剂盒检测方法 霉菌和酵母菌方法一1 范围本部分规定了食品中霉菌酵母菌测试片（Petrifilm TM Yeast and Mold count Plate）的检测方法。本部分适用于出口食品和原料中霉菌、酵母菌的计数。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求SN/T 2775 商品化食品检测试剂盒评价方法SN/T 3266 食品微生物检验方法确认技术规范3 生物安全措施为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员实施检测，所有培养物和废弃物的处理应按照 GB 19489 有关规定执行。4 技术概要霉菌酵母菌测试片法是用一种预先制备的含有指示剂及冷水可溶性凝胶的培养基系统进行微生物培养的方法。霉菌酵母菌测试片 PYM（Petrifilm TM Yeast and Mold）培养基中含有作为载体的冷水可溶性凝胶及对霉菌和酵母菌敏感的磷酸酶指示染剂，以及抑制细菌生长的四环素、氯霉素。圆形生长区域中划分为 30 个 1 cmx1 cm 便于计数的方格。5 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如：5.1 恒温培养箱：21 -255.2 电子天平：感量 0.1 g5.3 均质器（旋刀式或拍击式）或等效的设备，转数 8 000 rmin-10 000 rmin。5.4 pH 计或精密 pH 试纸：精密度 0.1。5.5 移液管：1 mL（具 0.01 mL 刻度），10 mL（具 0.1 mL 刻度）或电子移液器。5.6 测试片压板。5.7 放大镜或和菌落计数器。2SN/T 000020196 培养基和试剂6.1 无菌生理盐水：见 A.1。6.2 磷酸盐缓冲液：见 A.2。6.3 1 mol/L NaOH：见 A.3。6.4 1 mol/L HCI：见 A.4。6.5 PetrifilmTM 霉菌酵母菌测试片。本标准使用的试剂盒由 3 M 公司生产，参考 SN/T 2775 和 SN/T 3266 由国家认监委商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附录 B。试剂盒储存于 2 8，有效期 18 个月。7 检测程序检测程序见图 1。图 1 霉菌酵母菌测试片计数法检测程序8 操作步骤8.1 样品制备8.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的无菌均质杯内，80 r/min-1 000 r/min 均质 1 min-2 min，或放入 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用均质器拍打 2 min，使食品中的霉菌充分释放,制成 1：10 的样品匀液。8.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的无菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，以 30 cm 幅度、于 7 s 内振摇 25 次（或以机械振荡器振摇）制成 1:10 的样品匀液。样品匀液的 pH 值应为 6.5 7.5，pH 值过低或过高时可分别采用 3SN/T 000020191 mol/L NaoH 调节或 1 mol/L HCI 予以调节。如为冷冻产品,应在 45 以下不超过 15 min，或 2 5 不超过 18 h 解冻。8.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1：10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。8.1.4 按 8.1.3 操作程序，依次制成 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。8.2 样品匀液的接种和培养8.2.1 根据对样品的污染状况的估计及相关限量要求，选取 2 个 3 个适宣的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 2 张测试片。同时，分别吸取 1 mL 稀释液（磷酸盐缓冲液或生理盐水）加入两张测试片内作为空白对照。8.2.2 接种：将 PYM 测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取 1 mL 样液垂直滴加在测试片的中央，允许上层膜直接落下，但切勿向下滚动上层膜。手拿压板横杆，将压板放置在上层膜中央处平稳的压下吗，使样液均匀覆盖于圆形培养面积上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少 1 min以使培养基凝固。8.2.3 培养：将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数至多不能超过 20 片，21 C-25 C 培养 3 d 5 d。9 结果计算与报告9.1 判读9.1.1 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，培养 3 d 后持续观察计数，以 5 d 计数结果为估计菌落数；如果培养 5 d 后，测试片上目标菌生长过快，呈现边缘模糊的菌落，则以 3 d 计数结果作为估计菌落数。记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母菌数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。9.1.2 在 PYM 测试片上，将菌落颜色均匀一致，灰白色到盖绿色或粉红色，没有暗色中心，边界明显的小型隆起菌落计为酵母菌。颜色多样（棕色、米色、橙色、蓝绿色等，以霉菌产生不同色素而定）、中心颜色深暗的大型或小型扁平扩散菌落计为霉菌。9.2 菌落计数与报告9.2.1 选取菌落数在 15 CFU 150 CFU 之间的测试片计数霉菌和酵母菌菌落总数。低于 15 CFU 的测试片记录具体菌落数。每个稀释度应采用两个测试片的平均数。9.2.2 若只有一个稀释度的测试片的菌落数在适宜计数范围内，计算两个测试片菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中霉菌和酵母菌总数结果。9.2.3 若有两个连续稀释度的测试片菌落数在适宜计数范围内，按公式（1）计算。N=a（n1+0.1n2）d（1）式中：N 样品中霉菌和酵母菌总数；a 测试片（含适宜范围菌落数的平板），霉菌和酵母菌菌落数之和；n1 第一稀释度（低稀释倍数）测试片个数；n2 第二稀释度（高稀释倍数）测试片个数；d 稀释因子（第一稀释度）。4SN/T 000020199.2.4 若所有稀释度测试片上的菌落数都小于 15 CFU，则应按稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数计算。9.2.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）的测试片上均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。9.2.6 若所有稀释度的测试片菌落数均不在 15 CFU-150 CFU 之间，其中一部分小于 15 CFU 或大于150 CFU 时，则以最接近 15 CFU 或 150 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。计数菌落数大于 150 CFU 的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以 30 即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为 30 cm2）。9.3 报告9.3.1 霉菌和酵母菌总数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。9.3.2 霉菌和酵母菌总数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。9.3.3 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。9.3.4 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。5SN/T 00002019附 录 A（规范性附录）培养基和试剂A.1 无菌生理盐水A.1.1 成分氯化钠 8.5 g蒸馏水 1 000 mLA.1.2 制法称取 8.5 g 氯化钠溶于 1 000 mL 蒸馏水中，121 高压灭菌 15 min。A.2 磷酸盐缓冲液A.2.1 成分磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0 g蒸馏水 500 mLpH7.2A.2.2 制法贮存液：称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 mL 蒸馏水中，用大约 175 mL 的 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.20.1，用蒸馏水稀释至 1000 mL 后贮存于冰箱中。稀释液：取贮存液 1.25 mL，用蒸馏水稀释至 1000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min。A.3 ImoL/L NaOHA.3.1 成分NaOH 40.0 g蒸馏水 1000.0 mLA.3.2 制法取 40 g 氢氧化钠溶于 1000 mL 蒸馏水中。A.4 1 moL/L HCIA.4.1 成分HCI 90.0 mL蒸馏水 1000.0 mL6SN/T 00002019A.4.2 制法移取浓盐酸 90 mL,用蒸馏水稀释全 1000 mL。7SN/T 00002019附 录 B（资料性附录）霉菌酵母菌测试片（3 M PetrifilmTM Yeast and Mold Count Plate）评价结果B.1 线性和准确度表 B.1 各种样品线性方程和相关系数食品种类食品基质线性方程相关系数 R2动物饲料麸质饲料y=0.9968 x+0.03080.9981蛋白饲料y=1.0365 x-0.06020.9990水果和蔬菜制品绿豆y=0.9785 x+0.07310.9968丰桔子/肉制品深加工鸡肉y=0.9814 x+0.04760.9983木鸡肉/木猪肉/乳制品脱脂奶粉y=0.9846 x+0.04960.9990术全脂奶粉/杂品玉米粒y=1.0249 x-0.02150.9977瓜子仁y=0.9891 x 十 0.05680.9987面条y=0.9831 x+0.08980.9981方便米饭y-0.9855 x+0.14340.9878花生y=0.9623 x+0.13310.9993酱粒粉y=0.9836 x+0.06680.9996人参茶y=0.9713 x+0.09240.9967 注：y-测试片法菌落数的对数值；X-参考法菌落数的对数值术自然污染的样品，未做梯度检验，故无线性方程表 B.2 各类食品和饲料线性方程和相关系数食品种类Log 值范围线性方程相关系数 R2动物饲料1.18 3.49y=1.0057 x+0.01520.9980水果和蔬菜制品1.15 4.28y=1.0037 x+0.02680.9981肉制品1.20 3.23y=0.9836 x+0.0370.9940乳制品1.00 3.34y=0.9635 x+0.10850.9930杂品1.18