SNT 5516.7-2023 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增（RAA）检测方法 第7部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌.pdf

以正式出版文本为准I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 5 1 6.72 0 2 3 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌R e a l-t i m e r e c o m b i n a s e-a i d a m p l i f i c a t i o n d e t e c t i o n m e t h o d f o r p a t h o g e n s i n e x p o r t f o o dP a r t 7:S h i g a t o x i n-p r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i2 0 2 3-0 5-0 5发布2 0 2 3-1 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌S N/T 5 5 1 6.72 0 2 3*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 0中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0.7 5 字数2 1千字2 0 2 3年1 1月第一版 2 0 2 3年1 1月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 59 4 4 定价1 6.0 0元以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 5 1 6 出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R AA)检测方法 的第7部分。S N/T 5 5 1 6已经发布了以下部分:第1部分:沙门氏菌;第2部分:志贺氏菌;第3部分:金黄色葡萄球菌;第4部分:副溶血性弧菌;第5部分:克罗诺杆菌属;第6部分:大肠埃希氏菌O 1 5 7;第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌;第8部分:空肠弯曲菌;第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌;第1 0部分:小肠结肠炎耶尔森氏菌;第1 1部分:肺炎克雷伯氏菌;第1 2部分:铜绿假单胞菌;第1 3部分:蜡样芽孢杆菌;第1 4部分:产气荚膜梭菌;第1 5部分:霍乱弧菌;第1 6部分:创伤弧菌。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国上海海关、上海市疾病预防与控制中心、中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国杭州海关。本文件主要起草人:申进玲、蒋原、宁雪、许学斌、赵丽娜、杨捷琳、王建昌、李可、张晓峰。S N/T5 5 1 6.72 0 2 3以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口食品中致病菌荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R A A)检测方法第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌1 范围本文件规定了出口食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌的荧光重组酶介导链替换核酸扩增(R AA)检测方法。本文件适用于出口食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速筛选。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测S N/T 4 7 8 12 0 1 7 出口食品和饲料中产志贺毒素大肠埃希氏菌检测方法 实时荧光P C R法3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光R A A r e a l t i m e R A AR AA是一种核酸恒温扩增技术,在恒温下(一般为3 7 4 2),重组酶和寡核苷酸引物结合形成蛋白-D NA复合物,该复合物能够移动寻找模板D NA中的同源序列,在单链D NA结合蛋白的帮助下,打开模板D NA的双链结构,在D NA聚合酶的作用下,形成新的双链,产物呈指数级扩增。在e x o探针中包含一个四氢呋喃残基(TH F),其两侧分别为d T-荧光基团(F AM)和d T-淬灭基团(B HQ-1)。探针3 端通过适当的修饰(C 3 S p a c e r)被封闭,以阻止聚合酶的进一步延伸。只有当探针和目的D NA结合后,核酸外切酶(E x o n u c l e a s e,E x o)能够识别并切除TH F残基,并解除3 端阻断,荧光基团和淬灭基团分开并产生荧光信号,R AA产物与荧光信号的增长存在对应关系。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。B HQ 1:黑洞淬灭基团1(b l a c k h o l e q u e n c h e r 1)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d)d NT P:脱氧核糖核苷三磷酸(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e)E x o:核酸外切酶(E x o n u c l e a s e)1S N/T5 5 1 6.72 0 2 3以正式出版文本为准F AM:6-羧基荧光素(6-c a r b o x y f l u o r e s c e i n)P E G:聚乙二醇(p o l y e t h y l e n e g l y c o l)R AA:重组酶介导链替换核酸扩增(r e c o m b i n a s e-a i d a m p l i f i c a t i o n)s t x基因:志贺毒素基因(s h i g a t o x i n g e n e),包括两类s t x1和s t x2T r i c i n e:三(羟甲基)甲基甘氨酸(N-T r i s(h y d r o x y m e t h y l)m e t h y lg l y c i n e)4 技术概要以提取的D NA为模板,采用志贺毒素编码基因s t x1和s t x2特异性R AA引物和e x o探针,进行实时荧光R AA的扩增,根据实时荧光R AA的增幅情况,实现对食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速筛选。5 试剂和材料除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合G B/T 6 6 8 2一级水的要求。所有试剂均用无D NA酶污染的容器分装。5.1 检测用引物(对)序列和探针根据产志贺毒素大肠埃希氏菌s t x1和s t x2基因设计的上下游引物和一条e x o探针,详见表1。表1 引物和探针序列名称序列(5 3)目的基因上游引物s t x1-FT T A T C G C T T T G C T G A T T T T T C A C A T G T T A C C下游引物s t x1-RAAA T C C A G A T AA G AA G TA G T C AA C G AA T G G C Ge x o探针s t x1-PC T G G T G A C A G T A G C T A TA C C A C G T TA C AG C G T(F AM)-TH F-T(B HQ 1)-T G-C A G G G A T C A G T C G-C 3 S p a c e rs x 1基因上游引物s t x2-FT T T C C A T GA C AA C G G A C AG C AG T TA T A C C A C下游引物s t x2-RT C A T T G TA T TA C C A C T G AA C T C C A T TAA C G Ce x o探针s t x2-PC T G GAA C G T T C C G G AA T G C AAA T C A G T C G T(F AM)-C-TH F-C-T(B HQ 1)-C A C T G G T T T C A T C A-C 3 S p a c e rs x 2基因 注1:s t x1引物探针组合主要对最常见的重要变体s t x1 a扩增,对极少数的s t x1 b和s t x1 c也能扩增,但信号比s t x1 a稍弱。注2:s t x2引物探针对除了s t x2 f外的所有s t x2变体均能扩增。5.2 试剂5.2.1 细菌D NA提取试剂盒。5.2.2 R AA反应缓冲液:2 0%P E G。也可采用等效的商品试剂盒。5.2.3 2 8 0 mm o l/L乙酸镁。5.2.4 冻干酶制剂:1 mm o l/L d NT P、9 0 n g/L单链结合蛋白、1 2 0 n g/L r e c A重组酶、3 0 n g/L B s u D NA聚合酶、3 0 n g/L E x o,1 0 0 mm o l/L T r i c i n e、5 mm o l/L 二硫苏糖醇、1 0 0 n g/L肌酸激酶,保存于2 0 0 L反应管中冻干。也可采用等效的商品试剂盒。2S N/T5 5 1 6.72 0 2 3以正式出版文本为准5.2.5 阳性对照:产志贺毒素大肠埃希氏菌标准菌株,或含目的片段的D NA。6 仪器和设备6.1 荧光检测仪:具有恒温(3 9 1)扩增功能的荧光检测仪。6.2 微量移液器:1 0 0 L1 0 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,1 0 L1 0 0 L,0.5 L1 0 L,并配备与移液器匹配的吸头。6.3 高速台式离心机:离心力1 2 0 0 0g。6.4 恒温金属浴:1 0 0 1。6.5 天平:感量0.0 1 g。7 检测程序食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌实时荧光R AA检测程序见图 1。图1 食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌实时荧光R A A检测程序3S N/T5 5 1 6.72 0 2 3以正式出版文本为准8 操作步骤8.1 样品制备、增菌培养按照S N/T 4 7 8 12 0 1 7的方法进行样品制备和增菌。8.2 细菌模板D N A的制备8.2.1 增菌液模板D N A的制备对于8.1获得的增菌液,吸取1 m L菌液加入1.5 m L离心管中,1 2 0 0 0g离心2 m i n,弃上清。采用试剂盒中的细菌悬浮液重悬细菌,并按照细菌D NA提取试剂盒说明书制备模板D NA。8.2.2 可疑菌落模板D N A的制备对于分离到的可疑菌落,可直接挑取可疑单菌落于1 0 0 L无菌水混匀,沸水浴1 0 m i n,立即置冰上冷却,1 2 0 0 0g离心2 m i n,上清液即为模板D NA。也可使用等效的商品化细菌D NA提取试剂盒并按其说明书制备模板D NA。8.3 实时荧光R A A扩增8.3.1 实时荧光R A A反应体系产志贺毒素大肠埃希氏菌R AA检测,5 0 L反应体系见表2。表2 产志贺毒素大肠埃希氏菌实时荧光 R A A反应体系组分名称体积LR AA反应缓冲液2 5s t x1/s t x2-F(1 0 m o l/L)2.1s t x1/s t x2-R(1 0 m o l/L)2.1s t x1/s t x2-P(1 0 m o l/L)0.6D NA模板(2 0 n g/L)4.0无菌双蒸水1 3.7乙酸镁(2 8 0 mm o l/L)2.5总量5 0 注1:D NA模板量可根据不同样品,具体情况进行调整。注2:s t x1和s t x2检测为独立的两个R AA反应体系,应分别单独配制。注3:将除乙酸镁和模板D NA以外的所有成分涡旋混匀,分装混合液至含有冻干酶制剂的2 0 0 L反应管中,轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀,短暂离心,打开反应单元,向每个