SNT 5186-2020 鲍脓疱病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51862020鲍脓疱病检疫技术规范 Quarantine protocol for abalone pustule disease2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 05.150CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布SN/T 51862020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国海口海关、中华人民共和国厦门海关。本文件主要起草人：吴山楠、庞道标、郭书林、黄纪徽、冯斯敏、林道颖、张亮亮、陈平亚、李丹丹。SN/T 518620201鲍脓疱病检疫技术规范1 范围本文件规定了鲍脓疱病的临床诊断、病原分离、生化鉴定、PCR 检测法和荧光 PCR 检测法。本文件适用于鲍脓疱病的病原检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB 19489 实验室 生物安全通用要求GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 概述鲍脓疱病由河弧菌感染所致，主要感染 3 cm5 cm 的稚幼鲍，夏季连续高温季节发病频繁，持续时间长，死亡率高，在海南省及全国各地造成极其严重的经济损失。河弧菌是一种嗜盐菌，革兰染色阴性，顶端单鞭毛，具动力。本菌可产生肠毒素和细胞毒素。本菌对多数广谱抗菌药物敏感，但耐青霉素及头孢类抗生素。患脓疱病的鲍可见足肌上有若干个微微隆起的白色脓疱。脓疱的形状基本上为三角形，病灶是从腹足的下表面开始逐渐扩大、深入到足的内部。开始时，病灶较小，随着病程的进展，病灶逐渐扩大。临床检疫要求参见附录 A。5.试剂和仪器设备5.1 试剂5.1.1 除另有规定外，试验所需所有化学试剂均应为分析纯。5.1.2 试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，用于 DNA 提取及 PCR 试验的试验用水需用灭菌双蒸水。5.1.3 培养基。SN/T 5186202025.1.4 生化鉴定试剂：精氨酸二氢酶、赖氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脲酶、糖发酵管、微量生化管、生化鉴定试剂条或试剂盒等。5.1.5 细菌基因组提取试剂盒。5.1.6 PCR 引物序列如下：F1：5-GCCTGACTCAAGCCATCTCAACCC-3；R1：5-CTGTTGGTTGCCGTCATACTGCCT-3。5.1.7 实时荧光 PCR 引物和探针：F2：5-GACGCTTGGCAGTGTTCAAC-3；R2：5-GTGCATTCCACCATATTTTCTTACG-3；探针：5（FAM）-TGTCAGCACGCCAATCAATCACCCG（TAMRA）-3。5.1.8 TBE 电泳缓冲液。5.1.9 核酸染色剂。5.2 仪器设备5.2.1 冰箱。5.2.2 培养箱。5.2.3 普通 PCR 仪。5.2.4 高速冷冻离心机。5.2.5 天平。5.2.6 荧光 PCR 仪。5.2.7 生物安全柜。5.2.8 电泳仪。6.实验室诊断6.1 采样将活鲍解剖，取出足、外套膜、生殖腺、肝胰腺、消化管等组织器官，研磨后备用。采样数量、包装等可按照 GB/T 18088 或 SC/T 7 103 执行，输入国家或地区有特定要求的，按输入国家或地区采样。6.2 分离培养法6.2.1 增菌生物安全应符合 GB 19489 的相关规定。将 采 集 到 的 鲍 组 织 加 入 含 3%NaCl 的 碱 性 蛋 白 胨 水（见 B.1）中，于 36 1 培 养 8 h18 h。6.2.2 接种用接种环将培养液接种于 TCBS 培养基（见 B.2）上，于 36 1 培养 18 h24 h。6.2.3 纯培养选取单个黄色菌落接种于营养肉汤培养基（见 B.3），于 36 1 培养 18 h24 h。SN/T 5186202036.2.4 初步鉴定6.2.4.1 平板培养特性在 36 1 条件下培养 18 h24 h 后，河弧菌在 TCBS 上会出现黄色菌落。6.2.4.2 革兰染色选取纯培养后，按 GB 4789.28 对可疑菌落进行革兰染色，河弧菌为革兰阴性菌。6.2.5 生化鉴定经 6.2.4 初步确定为河弧菌的菌株，采用全自动生化鉴定系统或接种于添加有精氨酸二氢酶、赖氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脲酶、糖发酵管、氧化酶、吲哚等细菌微量生化鉴定管，置 36 1 培养 48 h，按细菌微量生化鉴定管说明书判定。赖氨酸脱梭酶、鸟氨酸脱梭酶、脲酶、VP 试验均为阴性；乳糖不发酵、不产 H2 S、葡萄糖产酸不产气；精氨酸二氢酶、氧化酶均为阳性的样品判定为河弧菌阳性。河弧菌主要生化鉴定结果见附录 C。6.3 PCR 检测法6.3.1 实验室要求实验室操作按照 GB/T 19495.2 的要求进行。6.3.2 核酸提取取经过 6.2.3 培养后的培养液 100 L 于离心管中，100 沸水浴 10 min，12 000 g 离心 3 min，取上清液作为模板进行 PCR 检测，或保存于-20 备用。也可采用商品化的细菌基因组提取试剂盒。6.3.3 PCR 反应体系采用 25 L 的反应体系，反应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。在 PCR 反应管中加入灭菌双蒸水 15.3 L，模板 1 L，3 mmol/L 的 MgCl2 1.5 L，10PCR 缓冲液 2.5 L，0.2 mmol/L 的 dNTP 0.5 L，5 U/L 的 Taq 酶 0.2 L，2.5 mmol/L 的引物 F1 和引物 R1 各 2 L。6.3.4 PCR 反应条件94 预变性 4 min；94 变性 1 min，56 退火 1 min，72 延伸 2 min，30 个循环；72 延伸7 min；4 保温。6.3.5 电泳用 TBE 电泳缓冲液（见 B.4）配制 1%的琼脂糖平板，加核酸 EB 染色剂（见 B.5）。将 8 L PCR产物和 2 L 样品缓冲液（见 B.6）混匀后加入凝胶孔，5 V/cm 电泳约 30 min，设立 DNA 分子量标准物作对照，在紫外灯下或凝胶成像仪中观察结果。6.3.6 PCR 结果判定阳性对照在 332 bp 处出现条带，阴性对照和空白对照不出现条带，实验成立。样品在 332 bp 处不出现条带，判定为阴性。样品在 332 bp 处出现条带，应切胶回收进行 DNA 测序，参考序列见附录 D。SN/T 5186202046.4 实时荧光 PCR 检测法6.4.1 核酸提取见 6.3.2 操作。6.4.2 荧光 PCR 反应体系采用 25 L 的反应体系，反应设立阳性对照和阴性对照。在 PCR 反应管中加入灭菌双蒸水 8.4 L，荧光 PCR 反应混合液 12.5 L，10 mol/L 的引物 F2 和引物 R2 各 0.3 L，10 mol/L 的探针 0.5 L，模板 3 L。也可在加样前配制反应体系，如有 n 个样品，可配制 n+2 个反应体系，之后分装于各反应管。6.4.3 荧光 PCR 反应条件第一阶段：95 10 min，1 个循环；第二阶段：95 15 s，60 1 min，40 个循环，在 60 退火延伸时搜集荧光。报告荧光设为 FAM，淬灭荧光设为 TAMRA，参照荧光设为 None（多重荧光PCR 淬灭荧光可选 ECLIPSE）。6.4.4 荧光 PCR 结果判定阴性对照无 Ct 值或 Ct 值 40，阳性对照 Ct 值 40 且出现 S 形扩增曲线，实验成立。样品无 Ct 值或 Ct 值 40，判定为阴性；样品 Ct 值 40 且出现 S 形扩增曲线，判定为阳性。SN/T 518620205附 录 A（资料性）临床检疫要求鲍脓疱病是由河弧菌感染鲍引发的传染病，为我国水生动物三类疫病。河弧菌为细菌域（Bacteria）变形菌门（Proteobacteria）变形菌纲（Gammaproteobacteria）弧菌目（Vibrionales）弧菌科（Vibrionaceae）弧菌属（Vibrio），革兰氏阴性，短杆状，大小为（0.6 m0.7 m）（1.2 m1.5 m），以单根极生鞭毛运动。生长温度范围为 15 42，最适生长温度为 30 37。可在 1%7%NaCl浓度范围内生长，2%3%NaCl 浓度生长最好，无 NaCl 的培养基中不生长。在 pH611 范围内可生长，pH78时生长最快。河弧菌的细胞壁较薄，厚度只有8 nm20 nm，细胞壁很容易与细胞质分离。细胞壁的外膜结构典型，为两个电子致密层夹一个透明层，状似细胞膜，其外膜没有荚膜和副结晶层结构。该菌的细胞质内含有簇状的糖原颗粒及游离核糖体等结构。胞外毒素所含的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、胶原酶及溶血因子等成分是主要的致病因子。鲍脓疱病在我国广泛流行，河弧菌以感染多种鱼类和皱纹盘鲍等水产养殖动物，以感染幼鲍和稚鲍为主。夏季易发病，特别是连续高温时，发病频繁且持续时间长，死亡率可高达 50%60%，因而造成极为严重的经济损失。脓疱病病原菌从鲍腹足上的伤口进入体内，通过血淋巴进入全身的组织，经过 13 个月的潜伏期，最后在足上出现病灶。因此，鲍腹足受伤是感染脓疱病的直接原因。当鲍体有外伤且体质下降时，便可感染此菌，从而导致脓疱病的出现。池塘养殖由于换水不彻底、不及时，而使养殖环境比较恶劣，交叉感染的机会很多，在疾病控制无效时，交叉感染更加严重，死亡率更高。病鲍的脓疱一般可维持一段时间不破裂，夏季持续高温时，病情加重，病程缩短，脓疱在较短时间内即行破裂。破裂脓疱流出大量白色脓汁并留下 2 mm5 mm 的深孔。镜检脓汁发现有运动能力的杆形细菌，使足面肌肉呈现不同程度的溃烂。此时病鲍附着能力差，或完全不能附着，食欲下降，直至脱落水中，饥饿而死。患脓疱病的鲍，腹足肌肉和结缔组织变性、坏死到逐渐瓦解消失。肌细胞核肿大，游离在脓汁中。脓汁中除了少量的肌细胞核、结缔组织细胞核、病原菌及许多组织细胞碎片等外，还有血淋巴细胞。脓疱病发展到了晚期，病灶内的所有结构都溶解消失，只残留下一些空腔。由于病灶内鲍足组织病变使鲍的运动、吸附、摄食能力下降或丧失，造成鲍的死亡。在病灶中，平滑肌原纤维排列混乱疏松并溶解，横纹肌原纤维的横纹淡化、模糊，也有溶解。早期病灶内的肌纤维核肿大，外膜外突呈疱状，部分地方破裂，核仁尚存在且明显，核质均质化。核的周围出现许多电子密度相似的圆形或椭圆性颗粒，放大后可见这些颗粒外被双层膜包裹。随着病情的加重，核仁消失，双层核膜破裂，核质外泄，病灶内的核糖体减少或消失，线粒体异形，嵴减少甚至消失使其呈双层膜的空泡状结构，肌糖原消失，内质网变成大小不一的圆形空泡。SN/T 518620206附 录 B（规范性）培养基与试剂B.1 3%NaCl 碱性蛋白胨水蛋白胨 10.0 g氯化钠 30.0 g蒸馏水 1 000.0 mL将以上各成分混匀，校正 pH 至 8.50.2，121 高压灭菌 10 min。B.2 TCBS 培养基蛋白胨 10.0 g酵母浸膏 5.0 g柠檬酸钠（C6H5O7Na32H2O）10.0 g硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）10.0 g氯化钠 10.0 g牛胆汁粉 5.0 g柠檬酸铁 1.0 g胆酸钠 3.0 g蔗糖 20.0 g溴麝香草酚蓝 0.04 g麝香草酚蓝 0.04 g琼脂 15.0 g蒸馏水 1 000.0 mL将以上各成分混匀，校正 pH 至 8.60.2，加热煮沸至完全溶解。冷至 50 左右倾注平板备用。B.3 营养肉汤培养基蛋白胨 10.0 g牛肉膏粉 3.0 g氯化钠 5.0 g蒸馏水 1 0