SNT 4920-2017 猪丹毒检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 49202017代替 SN/T 1017.22001ICS 65.020.30B 41猪丹毒检疫技术规范Quarantine protocol for swine erysipelas2017-11-07 发布2018-06-01 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布SN/T 49202017I前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张强、杨春华、林颖峥、花群义、李树清、熊炜、王艳、王昱、王巧全、李健。1SN/T 49202017猪丹毒检疫技术规范1 范围本标准规定了猪红斑丹毒丝菌的分离鉴定、SYBR Green荧光 PCR 试验和猪丹毒血清培养凝集试验的技术规范。本标准适用于猪丹毒的诊断及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件。其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GR/T 6682 分析实验室用水规格和分析方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。ER：红斑丹毒丝菌（erysipethrix rhusiopathiae）TSA：胰胨大豆琼脂（trypitc soy agar）TSB：胰胨大豆肉汤（tryptic soy broth）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）4临床症状见附录 A。5 病原分离鉴定5.1生物安全猪红斑丹毒丝菌是人畜共患病原菌，样品的处理、细菌学检查应在生物安全二级实验室操作；废弃物的处理应符合生物安全的管理规定。5.2样品采集无菌采集发病猪的耳静脉血和切开疹块挤压出的血液或渗出液。死亡病例、急性病例可采集被检猪的心血、肝、脾、肾、淋巴结等脏器；亚急性疹块病例可采集皮肤疹块病料；慢性病例可采集关节液和心内膜的增生物。采集样品如不能及时处理，可放置 4 冰箱冷藏。5.3细菌学检查制成的血涂片或脏器组织抹片，用革兰氏染色，镜检。红斑丹毒丝菌是一种纤细的革兰氏阳性小杆菌，菌体平直或稍弯。在血涂片上，可见到散在于红细胞之间的菌体，有的出现丛集，还能见到被2SN/T 49202017白细胞吞噬的现象。在脏器的抹片中，菌体常单独、成对或丛状排列。在瓣膜增生的显微组织和关节液涂片中，见到的红斑丹毒丝菌呈长丝状，构成丝状菌团。5.4分离培养将病料接种于pH值7.47.8含有5%健康马血清的马丁肉汤培养液（见B.1）、马丁琼脂培养基（见B.2）或 TSB 培养液（见 B.3）、TSA 血琼脂培养基（见 B.4），在 37 恒温箱中填养 24 h48 h。红斑丹毒丝菌在液体培养基中生长，使培养液变混浊，在 4 冰箱中放置 2 d3 d 后，在管底部有乳白色沉淀，轻轻将试管振动，沉淀物似絮状悬浮于液体中，有丝绸光泽。在马丁琼脂培养基上形成直径约为 0.8 mm1.0 mm 的透明呈露滴状的小菌落，继续培养至 4 d 以后，少数菌落发生变异，菌落边缘呈现不规则状。在 TSA 血琼脂培养基上培养 48 h 可形成直径均为 1 mm2 mm 边缘整齐的菌落，稍带蓝色光泽，初代分离的菌落出现轻度的 溶血。5.5生化试验取经过血琼脂培养基中 37 纯化培养 48 h 的菌落进行生化鉴定（见表 1）。葡萄糖果糖乳糖半乳糖蜜三糖海藻糖蔗糖松三糖鼠李糖山梨醇甘露醇肌醇甘油VP 试验菊糖水杨苷硫化氢试验吲哚试验明胶穿刺溶血型牛奶培养基新生霉素产酸不产气产酸不声气产酸不产气产酸不产气+试管刷样生长溶血凝固产酸抵抗表 1 红斑丹毒丝菌的生化鉴定表5.6血清型鉴定5.6.1试剂和器材5.6.1.1抗原制备将可疑菌落接种到 100 mL 含 5%健康马血清的马丁肉汤中，37 培养 36 h，0.5%甲醛溶液灭活 24 h，用 0.5%PBS 溶液洗涤离心（8 000 r/min，15 min）2 次，在沉淀物中加 3 mL 蒸流水，经 115 高压 15 min，离心（8 000 r/min，15 min），上清液为被检抗原。5.6.1.2标准阳性血清标准阳性血清一般为猪丹毒丝菌型特异性兔抗血清，由指定单位提供。5.6.1.3标准阳性抗原由指定单位提供。3SN/T 492020175.6.1.4打孔器孔内径 3 mm，可定制梅花形打孔器。5.6.2琼脂扩散试验5.6.2.1用 pH 值 7.2 的 PBS 配制 1.2%琼脂凝胶，加热融化后，在玻璃平皿中铺制成 3 mm 厚的胶板，凝胶凝固后打六角梅花形孔，孔径 3 mm，孔间距离 4 mm，小心挑出孔内琼脂，注意勿破坏周围琼脂。打完孔后在酒精灯火焰上加热封底。5.6.2.2中央孔加入 50 L 标准阳性血清。5.6.2.3周围孔分别加入 50 L 标准阳性抗原、被检抗原和 PBS 对照。5.6.2.4加样完毕后静置 10 min，然后放入 37 带盖湿盒中反应，24 h 观察结果，48 h 判定结果，72 h 终判。阳性血清与相对应的标准阳性抗原应出现沉淀线，与 PBS 不出现沉淀线，则试验成立。被检抗原与阳性血清孔之间出现沉淀线为阳性，无沉淀线为阴性。5.7SYBR Green l 荧光 PCR 试验5.7.1试剂 试验用水应符合 GB/T 6682 要求。5.7.1.1SYBR PCR 预混液，或其他具有等同效果的商品化试剂；5.7.1.2TSB 培养基；5.7.1.3DEPC 水，可选购商品化试剂。5.7.2设备5.7.2.1二级生物安全柜。5.7.2.2高压灭菌锅。5.7.2.3微量移液器。5.7.2.4高速冷冻离心机。5.7.2.5荧光 PCR 仪。5.7.3引物猪丹毒丝菌属特异性引物，扩增片段大小为 202 bp，序列为：ERI6S-F：5-AGTGTTGGAGAAATTCAG-3ERI6S-R：5-TCCGCCATAACTATTACA-3猪红斑丹毒丝菌特异性引物，扩增片段大小为 119 bp，序列为：ER1-F：5-GCAGATCGAGGGTAAGTACA-3ER2-R：5-TAACTACAACAGTGCGTAAG-3引物纯度为 HPLC 级，用 DEPC 水溶解至 10 mol/L 后，保存于-20 备用。5.7.4质控物质使用猪红斑丹毒丝菌（E.rhusaiopathiae，ATCC 19414，血清 2 型）作为阳性对照菌株，扁桃体丹毒丝菌（E.tonsillarum，ATCC 4339）作为阴性对照菌株，活菌经灭活后作为对照；用 DEPC 水作为空白对照。4SN/T 492020175.7.5样品的准备5.7.5.1将受测细菌单个菌落接种到 5 mL TBS 培养液内，液体样本或无菌研磨组织样本可直接接种5 mL TSB 选择性培养液（见 B.5），37 培养箱培养 48 h；同时制备阳性对照和阴性对照菌株菌液；5.7.5.2无菌取 1.5 mL 培养物到灭菌的离心管内；12 000 r/min 离心 3 min，弃去上清，加入 1.5 mL DEPC 水重悬沉淀；12 000 r/min 离心 3 min，弃去上清，再次加入 1.5 mL DEPC 水重悬沉淀。5.7.6核酸的提取将上述菌重悬液在沸水中煮 15 min，10 000 r/min 离心 3 min 沉淀菌体碎片，上清内即含有细菌基因组 DNA，将上清转移到干净的离心管内-20 保存备用。或将菌液直接离心，离心后弃去上清液，按细菌基因组 DNA 提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，然后将其溶于 50 L TE 中。5.7.7扩增反应体系配制每个 PCR 反应管内加入 10 L SYBR 荧光 PCR 反应预混液，4 条引物各加 1 L，再加入制备好的DNA 溶液 6 L，补充 DEPC 水至反应总体积 25 L，充分混合均匀。盖紧管盖后，500 r/min 离心 30 s。5.7.8荧光 PCR 反应将 5.7.7 中配制好的扩增体系放入荧光 PCR 仪内，记录样品摆放顺序，选定 SYBR 程序。设置如下反应参数：第一阶段，预变性 95/30 s；第二阶段，变性 95/15 s，退火 58/17 s，延伸 72/20 s，40 个循环，荧光收集设置在58 退火阶段进行；第三阶段，溶解曲线分析程序，95 0 s，65 15 s，95 0 s，前两步温度升降速度 20/s，最后一步温度升降速率 0.1/s。或使用仪器软作默认分析程序。5.7.9结果判定5.7.9.1 质控标准如阳性对照、阴性对照和空白对照不满足以下条件，此次实验视为无效：阳性对照出现两条溶解曲线，溶解温度在 85.60 0.80 和 75.67 0.79 ；阴性对照出现单一溶解曲线，溶解温度在 85.60 0.80 ；空白对照无扩增曲线。5.7.9.2 结果描述及判定扩增产物中同时出现两条溶解曲线，且溶解温度为 85.60 0.80 和 75.67 0.79，表明样本中存在猪红斑丹毒丝菌。扩增产物出现单一溶解曲线，且溶解温度为 85.60 0.80，表明样本中存在丹毒丝菌属成员，而非猪红斑丹毒丝菌。扩增产物未出现溶解曲线或非上述两种情况曲线，表明样本中不存在丹毒丝菌。5SN/T 492020176血清学试验（猪丹毒血清培养凝集试验）1）a6.1材料6.1.1培养基：马丁肉汤。6.1.2菌种：猪红斑丹毒丝菌血清 2 型强毒菌种。6.2操作步骤6.2.1无菌采被检猪血 5 mL，分离血清。6.2.2将被检血清用马丁肉汤分别稀释成 1:10 和 1:20。6.2.3每个稀释度的血清分别取 5 mL，56 灭活 30 min。6.2.4待灭活血清冷至 37 以下时，每管加入猪丹毒强毒菌株经 18 h 培养的马丁肉汤菌液 0.1 mL，置 37 静置培养 18 h，再取出放室温 2 h 后判定结果。6.2.5本试验同时设马丁肉汤和马丁肉汤培养的猪丹毒菌液作为对照管。6.3判定标准6.3.1被检血清培养物与菌液对照管比较观察，被检管和对照管一样均匀一致混浊，管底无凝聚块者为阴性（-）。6.3.2被检管培养物上层液体稍混浊，管底有凝集物沉淀者为弱阳性（+或+）。6.3.3被检管培养物澄清，无混浊状，管底有大量凝集物沉淀者为阳性（+或+）。6.4定性判定根据血清 1:10 和 1:20 两个稀释度出现的凝集程度综合判定。两个稀释度出现凝集程度的总和大于等于 5 个（+）者，判为阳性；两个稀释度出现凝集程度的总和等于 4 个（+）者，判为可疑，判为可疑的血清应重做，重做仍可疑判为阳性；两个稀释度出现凝集程度的总和小于等于 3 个（+）者，判为阴性。7综合判定7.1临床症状只能作为初步诊断的参考，应进一步采用实验室方法进行确诊。7.2细菌学检查和分离培养疑似的样品，需进行纯化培养，纯化菌落再进行生化试验，生化试验阳性的样品，判定为猪红斑丹毒丝菌阳性；荧光 PCR 方法阳性培养物，应通过生化试验鉴定，生化鉴定阳性的判定为猪红斑丹毒丝菌阳性。7.3血清学方法阳性的样品，判定为猪丹毒抗体阳性。1）此试验用于检测猪红斑丹毒丝菌特异性抗体。6SN/T 49202017附 录 A（资料性附录）疫病概况A.1疫病概况猪丹毒是由红斑丹毒丝菌引起的一种急性、热性传染病，人通过创伤也可被感染，称为类丹毒。丹毒丝菌属主要有两个种，猪红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）和扁桃体丹毒丝菌（Erysipelothrix tonsillarum）。猪丹毒自然病例遍布世界各地，主要是由血清型 1a、1b 或 2 的猪红斑丹毒丝菌所引起，而不常见的血清型对猪的毒力较低。扁桃体丹毒丝菌及包含潜在新种在内的少数菌株通常被认为对猪没有致病性。A.2临床症状A.2.1人工感染的潜伏期为 3 d5 d，最短为 24 h，最