SNT 5227.5-2019 出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）.pdf

以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5227.52019出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）Rapid detection of bovine derived ingredient in food for exportRecombinase-aid amplification（RAA）method2019-12-27 发布2020-07-01 实施ICS 67.050C 53中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 5227.52019I前 言SN/T 52272019出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）分为 11 个部分：第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。本部分为 SN/T 52272019 的第 5 部分。本部分按照 GB/T 1.12009 的规则进行编写。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、山东省食品药品检验研究院、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国福州海关。本部分主要起草人：苗丽、韩建勋、汪琳、霍胜楠、王娉、吴姗、罗宝正、郑秋月、孔繁德、林华、徐淑菲、郑晶。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 5227.52019出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）1 范围本部分规定了出口食品中牛源性成分（黄牛、牦牛）的 RAA 检测方法。本部分适用于出口食品中牛源性成分（黄牛、牦牛）的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1%（W/W）。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 牛 Bovine偶蹄目，反刍亚目，牛科，牛亚科，牛属，牛属下有 6 个种，分别为大额牛（印度野牛），牦牛，瓜哇野牛（白臀野牛），柬埔寨野牛（高棉牛），原牛，野牛（白肢野牛）。3.1.2 实时荧光 RAA Real-time RAA一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在恒温下（一般为 3742），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。3.1.3 Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.1.4 T 值 Time threshold每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。以正式出版文本为准2SN/T 5227.520193.2缩略语下例缩略语适用于本文件。3.2.1RAA：recombinase-aid amplification，重组酶介导扩增。3.2.2DNA：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。3.2.3CTAB：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。3.2.4Tris：tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。3.2.5EDTA：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。3.2.6dNTPs：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。3.2.7SSB：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。3.2.8SC-recA：Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。3.2.9BS-recA：Bacillus subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。3.2.10Bsu：Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。3.2.11Tricine：N-tris Hydroxymethyl methylglycine，N-三羟甲基甲基氨基酸。4 方法提要以提取的 DNA 为模板，采用牛的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中牛成分的检测鉴定。5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。表 1 检测用引物和探针物种名称引物/探针序列（5 3）扩增片段长度靶基因牛F：ATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATCTGCCTAATC173bp线粒体细胞色素b 基因（Cytb）R：CATTGAAGCTCCGTTTGCGTGTATGTATCGGP：CACTACACATCCGACACAACAACAGCATTCFAM-dTCTHFBHQ-dTCTGTTACCCATATCTG-C3spacer 注：目的基因序列见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer均为探针修饰基团。5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。5.2 酚：氯仿：异戊醇=25：24：1。5.3 异丙醇。5.4 70%乙醇（V/V）。以正式出版文本为准3SN/T 5227.520195.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。5.6 A Buffer（缓冲液 A）：20%聚乙二醇。5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/L SSB，300 ng/L recA 重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA），75 ng/L Bsu DNA 聚合酶，75 ng/L Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/L 二硫苏糖醇，250 ng/L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。5.8 B Buffer（缓冲液 B）：280 mM 醋酸镁。6 仪器设备6.1 实时荧光 PCR 仪。6.2 恒温荧光检测仪。6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4 恒温水浴锅。6.5 离心机：转速 12 000 r/min。6.6 微量移液器：量程 0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，200 L1 000 L。6.7 研钵及粉碎装置。6.8 涡旋震荡器。6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。7 检测步骤7.1 DNA 提取取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H2O 洗涤两次），加入 600 L CTAB 提取缓冲液，涡旋震荡混匀后于 70 温育 15 min，期间颠倒离心管 2 次 3 次；12 000 r/min 离心 5 min，取上清于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 L 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管 2 次 3 次后涡旋震荡混匀，12 000 r/min 离心 5 min；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，上下颠倒离心管 2 次 3 次，4 静置 30 min，4 下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 L 70%乙醇，重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 L 100 L TE（pH8.0）缓冲液溶解 DNA，-20 保存备用。DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。7.2 DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260和 A280。DNA的浓度按照公式（1）计算：c=AN50/1000 （1）公式中：c=DNA 浓度，单位为微克每微升（g/L）；A=260 nm 处的吸光值；N=核酸稀释倍数。当 A260/A280比值在 1.71.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。以正式出版文本为准4SN/T 5227.520197.3 实时荧光 RAA 扩增7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系表 2 实时荧光 RAA 反应总体系试剂体积/L实时荧光 RAA 扩增体系20 LA Buffer12.5 L正向引物(10 M)2.0 L反向引物(10 M)2.0 L探针(10 M)0.6 LDNA 模板(5 ng/L)2.0 LB Buffer2.5 L加 ddH2O 至50 L7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序可选用以下两种扩增仪器之一进行检测，反应程序对应如下。7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪39，60 s，1 个循环；39，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。7.3.2.2 恒温荧光检测仪39，1 min；39，20 min，第二阶段开始收集荧光。7.3.3 实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有牛源成分的样品作为阳性对照样品，不含牛源成分的样品作为阴性对照，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照。8 质量控制8.1 实时荧光 PCR 仪8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值 30.0。8.2 恒温荧光检测仪8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）15min。以正式出版文本为准5SN/T 5227.520199 结果判断与表述9.1结果判定9.1.1 实时荧光 PCR 仪9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。9