SNT 5207-2020 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52072020蓝莓休克病毒检疫鉴定方法Detection and identification of blueberry shock virus2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布SN/T 52072020I前 言本文件按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本文件主要起草人：蔡伟、谢丽雪、李雪珍、李韬、张永江、沈建国、高芳銮、吴祖建、陈寿铃。1SN/T 52072020蓝莓休克病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了蓝莓休克病毒检疫鉴定的原理，仪器设备、用具及试剂，检测与鉴定，结果判定与记录，以及样品的保存。本文件适用于进出境蓝莓种苗中蓝莓休克病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 基本信息蓝莓休克病毒的基本信息如下：学名：Blueberry shock virus，缩写：BlShV。分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）、等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）成员。蓝莓休克病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、病毒基因组等参见附录 A。5 原理蓝莓休克病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。6仪器设备、用具及试剂6.1仪器设备高速冷冻离心机、电子天平（1/1000 g）、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、-20 低温冰箱和-80 超低温冰箱、全自动酶联免疫分析系统、凝胶成像分析系统、pH 计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标仪等。6.2用具各种量程的可调移液器（1 000 L、200 L、100 L、20 L、10 L、2 L）、PCR 反应管、无 RNase 离心管（1.5 mL）、研钵、酶联板等。2SN/T 520720206.3试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）试剂见附录 B，普通 RT-PCR 检测试剂见附录 C，巢式 RT-PCR 检测试剂见附录 D，实时荧光 RT-PCR 检测试剂见附录 E。7检测与鉴定7.1抽样检查按照 SN/T 2122 给出的方法进行抽样、取样，并检查植株是否有矮化、畸型，叶片花叶、斑驳等疑似病毒危害症状。7.2DAS-ELISA检测方法见附录 B。7.3普通 RT-PCR 检测检测方法见附录 C。7.4巢式 RT-PCR 检测检测方法见附录 D。7.5实时荧光 RT-PCR 检测检测方法见附录 E。8结果判定与记录8.1结果判定8.1.1 DAS-ELISA 初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带 BlShV；若检测结果为阳性，则采用普通 RT-PCR 检测、巢式 RT-PCR 检测或实时荧光 RT-PCR 检测中的任一方法进行验证。8.1.2 若验证结果为阳性，则判定样品携带 BlShV。8.2结果记录记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片。9样品的保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20-80 超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。3SN/T 52072020附录A（资料性）蓝莓休克病毒的背景资料A.1分类地位蓝莓休克病毒是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）、等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）成员。A.2寄主范围已报道的自然寄主为蓝莓（Vaccinium spp.）。A.3病害症状主要症状是开花期时花和叶片突然完全坏死，导致不结果。据统计，该病毒侵染蓝莓造成的损失可达 34%90%。BlShV 几乎可侵染所有的蓝莓品种，并表现相似的症状。由于 BlShV 可通过蜜蜂携带感染的花粉传播，因此在田间扩散速度快，易大面积发生。Blshv 侵染蓝莓后引起的症状如图 A.1 所示。注：图 A.1 引自 http：/www.isaacslab.ent.msu.edu/Extension_Updates/BBshockalert.pdf图 A.1 BlShV 侵染蓝莓后引起的症状A.4分布地区主要分布于美国、加拿大等国家。A.5传播途径通过蜜蜂携带感染的花粉传播，也可经带毒种苗远距离传播。4SN/T 52072020A.6粒体形态病毒粒体呈等轴对称球状，直径约 27 nm。A.7病毒基因组正义单链 RNA 病毒。5SN/T 52072020附录B（规范性）双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）B.1试剂B.1.1包被抗体特异性的蓝莓休克病毒抗体。B.1.2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的蓝莓休克病毒抗体。B.1.3底物对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。B.1.41PBST 缓冲液（pH 7.4）氯化钠（NaCl）8.0 g磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15 g氯化钾（KCl）0.2 g吐温-20（Tween-20）0.5 mL溶于 900 mL 灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL，4 储存。B.1.5样品抽提缓冲液（pH 7.4）亚硫酸钠（Na2SO3）1.3 g聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24 00040 000）20.0 g溶于 900 mL 的 1PBST 中，并用 1PBST 定容至 1 000 mL，4 储存。B.1.6包被缓冲液（pH 9.6）碳酸钠（Na2CO3）1.59 g碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g溶于 900 mL 灭菌双蒸水中，并定容至 1 000 mL，4 储存。B.1.7酶标抗体稀释缓冲液（pH 7.4）牛血清白蛋白（BSA）2.0 g聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24 00040 000）20.0 g溶于 900 mL 1PBST 中，并用 1PBST 定容至 1000 mL，4 储存。B.1.8底物缓冲液（pH 9.8）二乙醇胺 97 mL氯化镁（MgCl2）0.1 g溶于 800 mL 灭菌双蒸水中，用浓盐酸（HCl）调 pH 至 9.8，定容至 1 000 mL，4 储存。6SN/T 52072020B.2程序B.2.1样品制备B.2.1.1检测样品称取 0.5 g1.0 g 样品组织，待测样品按 1:10（质量：体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，8 000 g 离心 10 min，上清液即为制备好的检测样品。B.2.1.2阳性对照样品蓝莓休克病毒的纯病毒或者组织抽提液，由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。B.2.1.3阴性对照样品由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。B.2.1.4空白对照样品用抽提缓冲液作空白对照。B.2.2包被抗体用包被缓冲液将包被抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，同 100 L 每孔，加盖，37 孵育2 h 或 4 冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 200 L 的量用 PBST 洗涤 46 次，每次1 min。B.2.3加样加入制备好的检测样品、阴性对照样品、阳性对照样品、空白对照样品，并且至少一个重复，100 L 每孔，加盖，37 孵育 2 h 或 4 冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 200 L的量用 PBST 洗涤 46 次，每次 1 min。B.2.4加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入酶联板中，100 L 每孔，加盖，37 孵育 2 h，倒去酶联板孔中溶液，用 PBST 洗涤 46 次。B.2.5加底物将底物 pNPP 加入底物缓冲液中，使终浓度为 1 mg/mL（现配现用），按 100 L 每孔加入酶联板中，室温避光孵育。B.2.6读数酶联仪在 405 nm 处读光密度（OD）值。B.3结果判断在全自动酶联免疫分析系统检测 405 nm 的 OD 值。在满足阴性对照孔的 OD405值小于 0.15、阳性对照孔的 OD405值/阴性对照孔的 OD405值大于 5 小于 10，孔的重复性基本一致的质量要求后，样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显大于 2，判为阳性。样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显小于 2，判为阴性。7SN/T 52072020附录C（规范性）普通 RT-PCR 检测方法C.1试剂C.1.1TrizoL 裂解液。C.1.25TBE 缓冲液：含 54.0 g Tris 碱、27.5 g 硼酸（H3BO3）和 20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）,补充蒸馏水至 1L。用时加蒸馏水稀释至 0.5TBE。C.1.36 加样缓冲液:含 0.25%溴酚蓝、40%（质量/浓度）蔗糖水溶液。C.1.4三氯甲烷。C.1.5异丙醇。C.1.675%乙醇。C.1.7无水乙醇。C.1.8RT 缓冲液。C.1.9dNTPs:10 mmol/L。C.1.10M-MLVRT:200 U/L。C.1.11RNasin:40 U/L。C.1.12Taq PCR mix。C.1.13引物序列：根据已报道的 BlShV 基因组序列设计了一对用于特异性扩增的引物。正向引物 BlShVf：5-CCCCAAAGGATAAACAGGTCCA-3反向引物 BlShVr：5-TCACCACGTACAAATCCCT-3RT-PCR 产物大小 450 bp。C.2普通 RT-PCR 检测C.2.1总 RNA 提取取样品提取液 200 L 放入 1.5 mL 离心管中，再加入 1 mL TrizoL 裂解液，剧烈振荡摇匀 3 min，4，12 000 g 离心 10 min，取上清液；加入三氯甲烷 300 L，剧烈震振 15 s，室温静置 5 min，4，12 000 g 离心 15 min，取上层水相液；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置 15 min，4，12 000 g 离心 10 min，弃上清液；加入 1 mL 75%的乙醇洗涤沉淀 2 次，每次 4，7 500 g 离心 3 min，弃上清液；RNA 沉淀干燥后，用 20 L40 L 经 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的 ddH2O溶解，-20 保存备用。注：总 RNA 的提取也可采用商品化试剂盒。C.2.2cDNA 合成在 PCR 反应管中加入 3 L 总 RNA、1 L 反向引物（10 mol/L）、7 L ddH2O，70 水浴 10 min，迅速冰浴 5 min，再加入下列试剂：5 L 5RT 缓冲液、2 L dNTPs（10 mmol/L）、1 LM-MLVRT（200 U/L）、1 L RNasin（40 U/L），42 水浴 60 min，70 水浴 10 min，自然冷却至室温，-20 保存备用。C.2.3PCR 扩增PCR 反应体系见表 C.1，每个反应设置 2 个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白8SN/T 52072020对照。PCR 反应条件：94 预变性 5 min，然后 94 变性 30 s、56 退火 45 s、72 延伸 1 min，35 个循环，最后一个循环结束后 72 继续延伸 10 min。注：PCR 扩增可以采用商品化试剂盒。表 C.1 普通 RT-PCR 反应体系cDNA3.0正向引物 BlShVf（10 mol/L）1