SNT 5170-2019 出口动物源食品中肾上腺素和去甲肾上腺素的测定.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51702019出口动物源食品中肾上腺素和去甲 肾上腺素的测定Determination of adrenaline and noradrenaline in animal-origin foodstuffs for export2019-10-25 发布2020-05-01 实施中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布ICS 67.050C 53ISN/T 51702019前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国武汉海关、武汉食品化妆品检验所、湖北省食品质量安全监督检验研究院。本标准主要起草人：江小明、王鹏、叶诚、江丰、陈丹、赵晓亚、王晗、罗静、王振华、詹承勇。1SN/T 51702019出口动物源食品中肾上腺素和去甲肾上腺素的测定1 范围本标准规定了出口动物源食品中肾上腺素、去甲肾上腺素残留量的液相色谱测定方法和液相色谱-质谱/质谱确证方法。本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、牛奶、鸡蛋中肾上腺素、去甲肾上腺素残留量的测定，其他食品也可参照使用。2 规范性引用文件下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 方法提要猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋中肾上腺素和去甲肾上腺素经焦性没食子酸-乙二胺四乙酸二钠溶液提取，三氯甲烷去蛋白，乙腈饱和正己烷溶液除脂；牛奶用高氯酸溶液提取。试样用阳离子固相萃取小柱净化后，经液相色谱仪测定，基质添加标准曲线外标法定量，阳性样品采用液相色谱-质谱/质谱仪进行定性确证。4 试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。4.1甲醇（CH3OH，CAS 号：67-56-1）：色谱纯。4.2乙腈（CH3CN，CAS 号：75-05-8）：色谱纯。4.3甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6）：色谱纯。4.4正己烷（C6H14，CAS 号：110-54-3）。4.5三氯甲烷（CHCl3，CAS 号：67-66-3）。4.6磷酸（H3PO4，CAS 号：7664-38-2）。4.7高氯酸（HClO4，CAS 号：7601-90-3）：含量 70%72%。4.8磷酸二氢钾（KH2PO4，CAS 号：7778-77-0）。4.9乙酸铵（CH3COONH4，CAS 号：631-61-8）。4.10焦性没食子酸（C6H6O3，CAS 号：87-66-1）。4.11乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8，CAS 号：139-33-3）。4.12肾上腺素标准物质（C9H13O3N，CAS 号：51-42-3）：纯度大于等于 95%。4.13去甲肾上腺素标准物质（C8H11NO3，CAS 号：51-41-2）：纯度大于等于 95%。4.14高氯酸溶液（pH=2.00.2）：吸取约 0.4 mL 高氯酸（4.7）至 1 L 水中，配制成 pH=2.00.2的高氯酸水溶液。4.15试样提取液：准确称取 1.26 g 焦性没食子酸（4.10）、1.86 g 乙二胺四乙酸二钠（4.11），加2SN/T 51702019入 950 mL 水，加 50 mL 乙腈（4.2）混合均匀。4.16乙腈饱和正己烷：量取 80 mL 正己烷（4.4）于 100 mL 分液漏斗中，加入适量乙腈（4.2）后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层即得。4.17磷酸二氢钾-磷酸水溶液（pH=4.0）：准确称取 2.72 g 磷酸二氢钾（4.8），用水定容至 1 L，用磷酸（4.6）调节 pH 至 4.0。4.180.1%甲酸甲醇溶液：准确移取 1 mL 甲酸（4.3），用甲醇（4.1）定容至 1 000 mL。4.19洗脱液：移取 2 mL 甲酸（4.3）加入 100 mL 的乙腈-水溶液（85：15，体积比）中。4.20100 mmol/L 乙酸铵溶液：准确称取 3.85 g 乙酸铵（4.9），用水溶解，定容至 500 mL。4.2140 mmol/L 乙酸铵溶液：准确称取 1.54 g 乙酸铵（4.9），用水溶解，定容至 500 mL。4.220.5 mmol/L 乙酸铵溶液：准确称取 0.038 5 g 乙酸铵（4.9），用水溶解，定容至 1 L。4.23标准储备液：准确称取适量的肾上腺素标准物质（4.12）、去甲肾上腺素标准物质（4.13），均精确至 0.000 1 g，用 0.1%甲酸甲醇溶液（4.18）溶解，配制成浓度为 1 000 mg/L 的标准储备液，-18 条件下避光保存，有效期 3 个月。4.24混合标准中间溶液：分别准确移取 5.0 mL 肾上腺素、去甲肾上腺素的标准储备液（4.23）至100 mL 棕色容量瓶中，用 0.1%甲酸甲醇溶液（4.18）稀释至刻度，配制成浓度为 50.0 mg/L 的标准中间溶液，于-18 条件下避光保存，有效期 1 个月。4.25基质混合标准工作溶液：将混合标准中间溶液（4.24）用磷酸二氢钾-磷酸水溶液（4.17）稀释成浓度为 2.50 mg/L50.0 mg/L 的标准系列溶液，称取与试样基质相应的阴性样品 5 g，加入标准系列溶液 100 L，与试样同时进行提取和净化，得到浓度分别为 125 g/L2 500 g/L 的基质混合标准工作溶液。4.26阳离子固相萃取（SPE）小柱：填料为 N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基质-COOH 6 mL（150mg）或性能相当者。使用前依次用 6 mL 甲醇（4.1）、6 mL 水对柱子进行活化。4.27微孔滤膜：通用型，0.22 m。5仪器与设备5.1液相色谱仪：配荧光检测器。5.2液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.3组织捣碎机。5.4涡旋混合器。5.5电子分析天平：感量为 0.000 1g 和 0.01g。5.6高速冷冻离心机：转速不低于 8 000 r/min。5.7氮气吹干仪。5.8pH 计。6试样制备与保存6.1试样制备6.1.1猪肉、牛肉、羊肉猪肉、牛肉、羊肉各约 500 g，放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内，并标明标记。3SN/T 517020196.1.2鸡蛋取 16 枚新鲜鸡蛋（约 1 kg），洗净、去壳后充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内，并标明标记。6.1.3牛奶将牛奶从冰箱中取出，放置至室温、摇匀，备用。制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。6.2试样保存猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋试样于-20 以下条件下保存；牛奶试样置于 0 4 条件下保存。7测定步骤7.1提取7.1.1猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋称取试样 5 g（精确到 0.01 g）于 50 mL 具塞离心管中，加入 10 mL 试样提取液（4.15），涡旋提取 1 min，加入 5 mL 三氯甲烷（4.5），涡旋混匀 30 s，以 8 000 r/min 的转速离心 10 min后，取全部上清液于另一 50 mL 离心管中，加入 5 mL 乙腈饱和正己烷（4.16），涡旋混匀 30 s，以 8 000 r/min 的转速离心 3 min，收集下层清液，用 100 mmol/L 乙酸铵溶液（4.20）定容到25 mL，待净化。7.1.2牛奶称取试样 5 g（精确到 0.01 g）于 50 mL 具塞离心管中，加入 20 mL 高氯酸溶液（4.14），静置20 min，于 4 经涡旋提取 1 min，以 8 000 r/min 的转速离心 10 min，取出上清液，用 100 mmol/L乙酸铵溶液（4.20）定容到 50 mL，待净化。7.2净化猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋样品取 7.1.1 中待净化溶液 12.5 mL 过 SPE 小柱（4.26）；牛奶样品取7.1.2 待净化溶液 25 mL 过 SPE 小柱（4.26）。控制流速为 1 mL/min2 mL/min，再依次用 5 mL 40 mmol/L 乙酸铵溶液（4.21）和 5 mL 甲醇（4.1）淋洗柱子，经真空抽干，用 5 mL 洗脱液（4.19）洗脱，控制流速为 1 mL/min2 mL/min，收集洗脱液，用氮气吹至干，用磷酸二氢钾-磷酸水溶液（4.17）定容至 1 mL，过 0.22 m 微孔滤膜（4.27），供液相色谱仪分析。7.3测定7.3.1液相色谱条件7.3.1.1 色谱柱：C18色谱柱，250 mm4.6 mm（内径），粒径 5.0 m 或性能相当者。7.3.1.2 柱温：35。7.3.1.3 流动相：A 为磷酸二氢钾-磷酸水溶液（pH=4.0）（4.17），B 为甲醇（4.1），梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1。4SN/T 51702019表 1 液相色谱的梯度洗脱程序时间/min流动相 A/%流动相 B/%0973597310356515356515.19737.3.1.4 柱流速：1 mL/min。7.3.1.5 进样量：10 L。7.3.1.6 检测器激发波长：285 nm。7.3.1.7 发射波长：320 nm。7.3.2定量测定待测样品中化合物色谱峰的保留时间与基质混合标准工作溶液相比，变化范围应在 2.5%之间。将基质混合标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱仪中，保留时间定性，测得待测物峰面积。待测样液中肾上腺素、去甲肾上腺素的响应值均应在仪器检测的定量线性响应范围内。肾上腺素、去甲肾上腺素的液相色谱图参见附录 A。7.4液相色谱-质谱/质谱确证7.4.1阳性样品的确证对于液相色谱方法检出阳性的样品，采用液相色谱-质谱/质谱方法进行定性确证。7.4.2液相色谱条件7.4.2.1 色谱柱：C18色谱柱，50 mm2.1 mm（内径），粒径 1.7 m 或性能相当者。7.4.2.2 柱温：35。7.4.2.3 流动相：A 为 0.5 mmol/L 乙酸铵溶液（4.22），B 为 0.1%甲酸甲醇溶液（4.18），梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 2。表 2 液相色谱的梯度洗脱程序时间/min流动相 A/%流动相 B/%090101.590105.51090710901090107.4.2.4 柱流速：0.25 mL/min。7.4.2.5 进样量：10 L。5SN/T 517020197.4.3质谱条件7.4.3.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）。7.4.3.2 扫描方式：正离子扫描。7.4.3.3 检测方式：多反应监测模式（MRM）。7.4.3.4 监测离子对、定量离子对见表 3。表 3 肾上腺素、去甲肾上腺素的监测离子对、定量离子对被测物监测离子对（m/z）定量离子对（m/z）肾上腺素184.1/166.1184.1/107184.1/166.1去甲肾上腺素152.3/107152.3/135152.3/1077.4.3.5 使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考质谱条件参见附录 B。7.4.4定性测定按照液相色谱-质谱/质谱条件测定试样和基质混合标准工作溶液，试样中目标化合物的保留时间与基质混合标准工作溶液中对应化合物的保留时间偏差在 2.5%之内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质混合标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 4 的规定，且每个定性离子的信噪比均 3，则可判断试样中存在相应的被测物。在上述仪器条件下，肾上腺素、去甲肾上腺素的提取离子色谱图参见附录 C。表 4 定性离子对相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%502050（含）1020（含）10允许的相对偏差/%202530507.5空白试验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。8结果计算和表述采用基质匹配标准曲线定量，试样中肾上腺素、去甲肾上腺素的含量由液相色谱仪和液相色谱-质谱/质谱仪的数据处理软件按式（1）计算，计算结果应扣除空白值。c VfXm=（1）式中：X试样