SNT 5145.7-2019 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第7部分：绵羊成分检测 PCR-试纸条法.pdf

书 书 书犐 犆犛 犆 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第部分：绵羊成分检测犘犆犚 试纸条法犚犪 狆 犻 犱犐 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狀 犻 犿犪 犾犻 狀 犵 狉 犲 犱 犻 犲 狀 狋犻 狀犲 狓 狆 狅 狉 狋犳 狅 狅 犱犪 狀 犱犳 犲 犲 犱犘 犪 狉 狋：犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犗狏 犻 狊犪 狉 犻 犲 狊犐 狀 犵 狉 犲 犱 犻 犲 狀 狋犘犆犚 犔犪 狋 犲 狉 犪 犾犳 犾 狅狑犱 犻 狆 狊 狋 犻 犮 犽犿犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国海关总署发 布书 书 书前言 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法分为以下 个部分：第部分：猫成分检测 试纸条法；第部分：貂成分检测 试纸条法；第部分：鹿成分检测 试纸条法；第部分：骆驼成分检测 试纸条法；第部分：狗成分检测 试纸条法；第部分：牛成分检测 试纸条法；第部分：绵羊成分检测 试纸条法；第部分：驴成分检测 试纸条法；第部分：狐狸成分检测 试纸条法；第 部分：鹅成分检测 试纸条法；第 部分：鸭成分检测 试纸条法；第 部分：火鸡成分检测 试纸条法；第 部分：鸽子成分检测 试纸条法；本部分是 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津海关，天津师范大学，中华人民共和国西宁海关，北京华大蛋白质研发中心有限公司，天津科技大学。本部分主要起草人：郑文杰、李宗梦、凤晓博、刘国红、张霞、赵良娟、张宏伟、王硕、尹长城、孙金生。犛犖犜 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第部分：绵羊成分检测犘犆犚 试纸条法范围本部分规定了食品及饲料中绵羊成分检测的 试纸条方法。本部分适用于肉、肉制品及饲料中绵羊成分的定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法 饲料采样 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适应于本文件。绵羊犗狏 犻 狊犪 狉 犻 犲 狊属于哺乳纲，偶蹄目，牛科，绵羊属。本标准中绵羊成分即指绵羊特异性片段。缩略语下列缩略语适用于本文件。：，脱氧核糖核酸。：，脱氧核苷酸三磷酸。：，十六烷基三甲基溴化铵。：（），三羟甲基氨基甲烷。：，乙二胺四乙酸。：，异硫氰酸盐。方法原理利用裂解液破碎样本细胞，苯酚氯仿法抽提基因组，以提取的为模板，采用上游和下游引物分别经异硫氰酸盐（，）和生物素（）标记进行扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗犛犖犜 体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对产物进行筛选检测，并对阳性产物进行测序确证。试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 的要求。绵羊源性成分检测用引物（对）序列及标记物为：绵羊成分扩增引物详见表。表试验用引物物种名称引物序列（）端标记物靶基因绵羊：异硫氰酸盐（）：生物素（）犆犢犜犅 试剂 聚合酶（，）。：（，脱氧腺苷三磷酸）、（，脱氧胸苷三磷酸）、（，脱氧胞苷三磷酸）、（，脱氧鸟苷三磷酸）。缓冲液：（），。三氯甲烷（氯仿）。异丙醇。提取液：，。沉淀液：，。酚三氯甲烷异戊醇溶液：按照 饱和酚：三氯甲烷异戊醇溶液体积比为 进行配制。三氯甲烷异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为 进行配制。乙醇（）。溶液（）。蛋白酶（）。试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条，可通过采购的原料试剂自行组装（参见附录）或采用等效的商品化试纸条。展开液：、（）以及浓度为 的；或采用等效的商品化产品。仪器设备 离心机（离心力 ），。微量移液器（，）。仪。犛犖犜 恒温水浴锅，。天平：感量 。计。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检验步骤 样品制备 食品将固状待检样品研磨混匀，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装。加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。饲料饲料样品按照 采样，或若粒度为 目称取 ，目称取 ，目称取 。样品犇犖犃提取称取 样品于离心管中，加入提取液，加入 蛋白酶，温育，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量提取缓冲液；取出后 离心 ，转移上清至离心管中，加入等体积的室温酚三氯甲烷异戊醇（）颠倒混匀，转速下离心 ；转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷异戊醇（），颠倒混匀，室温下 离心 ；转移上清至干净离心管中，加入等体积的沉淀液混匀，室温沉淀；加入 倍体积的异丙醇或倍体积 冰箱中预冷的无水乙醇混匀，放置 ，离心 ，弃上清，用 乙醇洗涤沉淀一次，离心 ，弃上清，室温下晾干。加入 双蒸水，室温 ，混匀，保存。上述方法可用等效提取试剂盒提取模板。犇犖犃浓度和纯度的测定取溶液加双蒸水稀释至，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 和 处的吸光值 和 。的浓度按式（）计算：犆犃犖 （）式中：犆 浓度，单位为微克每微升（）；犃 处的吸光值；犖 核酸稀释倍数。当 比值在 之间时，适宜于扩增。犘犆犚扩增 犘犆犚反应体系见表。犛犖犜 表犘犆犚反应体系试剂体积 缓冲液（含）正向引物（）反向引物（）（）模板（）（）灭菌 反应条件 预变性；变性 ，退火 ，延伸 ，个循环后进入 。反应条件随不同的仪略有改变。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含绵羊源性成分的样品作阳性对照，用已知不含绵羊源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板作空白对照。试纸条检测取产物点于核酸试纸条样品垫，加入到 展开液中进行检测，后观察结果。质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：）空白对照：质控线变红，检测线未变红。）阴性对照：质控线变红，检测线未变红。）阳性对照：质控线变红，检测线变红。结果判断与报告 结果判定试纸条质控线变红色，且检测线变红色，扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证（序列参见附录）。试纸条质控线变红色，检测线不变色，扩增产物为阴性。结果报告产物试纸条检测为可疑阳性，同时测序结果与 基因库同源性达到 及以上者，判为含有绵羊源成分，结果报告为检出绵羊源成分；产物试纸条检测为可疑阳性，测序结果与 基因库同源性低于 者，视比对结果具体分析，判定是否含有绵羊源成分；产物试纸条检测为阴性，判为不含有绵羊源成分，结果报告为未检出绵羊源成分。犛犖犜 检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照 中附录的规定执行。废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检出限本部分所规定方法的最低检出限（）为（质量分数）。犛犖犜 附录犃（资料性附录）含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条犃 组成成分犃 抗 抗体单克隆抗体或多克隆抗体：单克隆抗体：鼠单克隆抗体多克隆抗体：兔多克隆抗体犃 质控线上的二抗：依据上述兔多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗兔或者羊抗鼠抗体。犃 链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组 蛋白犃 试纸条结构 吸水滤纸垫；结合物垫，附有 抗体（兔源）与胶体金颗粒的交联体；侧向层析基质（硝酸纤维素膜）；检测带，附有链亲和素；质控带，附有可结合兔源抗体的抗体；衬底；吸水垫。犃 试纸条检测原理检测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（）的兔多克隆抗体，可与产物一条链上的标记分子结合，在检测线位置上固定有链亲和素，可与产物另一条链上的生物素结合。阳性扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合，通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗兔抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性扩增的产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的引物因带有异硫氰酸盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获向上一直移动至质控线被羊抗兔抗体捕获而显色。犛犖犜 附录犅（资料性附录）犘犆犚产物测序结果绵羊源性成分的基因扩增靶标参考序列（犵 犲 狀 狀 犫 犪 狀 犽号：犃犉 ）犛犖犜