SNT 5196-2020 猪轮状病毒感染检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51962020代替 SN/T 11622002猪轮状病毒感染检疫技术规范Quarantine protocol for infection with porcine rotavirus中华人民共和国海关总署发 布ICS 11.220CCS B 412020-12-30 发布2021-07-01 实施ISN/T 51962020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中国人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国海口海关、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。本文件主要起草人：张体银、姜焱、聂丹、郑腾、花群义、李丹丹、王武军、白泉阳、张志灯、于师宇、陈美传。1SN/T 51962020猪轮状病毒感染检疫技术规范1范围本文件规定了猪轮状病毒感染酶联免疫吸附试验、反转录-聚合酶链反应和实时荧光反转录-聚合酶链反应检测技术。本文件适用于猪轮状病毒感染的抗体检测和病原核酸鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088出入境动物检疫采样GB 19489实验室生物安全通用要求3术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件：cDNA 互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid）Ct 循环阈值（cycle threshold）ddH2O 双蒸水（couble-distillation H2O）DEPC 焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate）dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleoside triphosphate）EB 溴化乙锭（ethidium bromide）ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）HRP 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）OD 值 光密度值（optic density value）PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline buffer）PRV 猪轮状病毒（porcine rotavirus）RNA 核糖核酸（ribonucleic acid）RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction）TBE 三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（trihydroxymethyl aminomethane-boric acid-ethylene diamine tetraacetic acid）4仪器和设备4.1级生物安全柜。4.2高压灭菌器。4.396 孔酶标板。2SN/T 519620204.4恒温培养箱。4.5洗板机。4.6酶标仪。4.7冷冻离心机。4.8单道可调微量移液器（2 L20 L，20 L200 L，100 L1 000 L）。4.9多道可调微量移液器（10 L100 L）。4.10PCR 仪。4.11水平电泳仪。4.12凝胶成像仪。4.13荧光 PCR 仪。4.14冰箱（2 8 和 20）。5试剂和材料5.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2猪轮状病毒 VP6 蛋白。5.3标准阳性血清：猪轮状病毒疫苗免疫仔猪制备，经病毒中和试验检测为阳性。5.4标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪轮状病毒疫苗的仔猪血清，经病毒中和试验检测为阴性。5.5灭菌生理盐水：配制见附录 A 中 A.1。5.6包被液：配制见附录 A 中 A.2。5.7磷酸盐缓冲液（PBS）：配制参见附录 A 中 A.3。5.8洗涤液：配制见附录 A 中 A.4。5.9封闭液：配制见附录 A 中 A.5。5.10样品稀释液：配制见附录 A 中 A.6。5.11抗猪 PRV 酶标抗体。5.12底物显色液：配制见附录 A 中 A.7。5.13终止液：配制见附录 A 中 A.8。5.14焦碳酸二乙酯处理水（DEPC 水）：配制见附录 A 中 A.9。5.15Trizol。5.16三氯甲烷。5.17异丙醇。5.18无水乙醇。5.19反转录试剂盒。5.20Taq DNA 聚合酶。5.21dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。5.2210PCR 缓冲液。5.23琼脂糖。5.24分子量标准（100 bp 600 bp）。5.25TBE 电泳缓冲液，配制见附录 A 中 A.10。5.26上样缓冲液，配制见附录 A 中 A.11。5.27EB（10 mg/mL），配制见附录 A 中 A.12。5.28DNA 纯化回收试剂盒。5.29质控物质：阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液；阴性对照为不含 PRV 的组织。3SN/T 519620205.30RT-PCR 用引物 F1、R1 序列：上游引物 F1：5-AAAGATGCTAGGGACAAAATTG-3；下游引物 R1：5-TTCAGATTGTGGAGCTACTCCA-3。扩增 PRV 各毒株保守序列中大小为 309 bp 片段（参见附录 B），引物用 ddH2O 溶解至 10 mol/L 后，保存于-20 备用。5.31实时荧光 RT-PCR 用引物 F2、R2 和探针序列：上游引物 F2：5-AGCATGTTGATTAAGTGAGGACT-3下游引物 R2：5-ACAGTTACTCTACGTAGCGAGT-3；探针序列为 FAM-AGGCTAACTACCTGGTATCCGA-TAMRA。引物和探针分别用 ddH2O 溶解至 10 mol/L 后，保存于-20 备用。6采样和制样6.1根据 GB/T 18088 确定采样动物数量；涉及病原检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照 GB 19489 要求进行。6.2血清样品：通过前腔静脉采血法无菌采血，待其自然凝固后，4 000 r/min 离心 10 min。6.3粪便或肛拭子样品：采集粪便样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 5 000 r/min 离心 15 min，收集上清液待检。采集肛拭子样品，用少量灭菌生理盐水浸润后，取上清液待检。6.4组织样品：采集肠、胃等组织样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 5 000 r/min 离心 15 min，收集上清液待检。7ELISA 检测方法7.1操作步骤7.1.1包被抗原：将纯化的 VP6 蛋白用包被液稀释至 3 g/mL，每孔 100 L，包被酶标板，封口后，2 8 包被 12 h。ELISA 检测方法可以采用等效的商品化 ELISA 抗体检测试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作。7.1.2弃去孔内液体，每个反应孔加入约 300 L 的洗涤液进行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸水纸上将酶标板拍干。7.1.3封闭：每孔加入封闭液 250 L，置 37 培养箱中封闭 2 h。7.1.4重复步骤 8.1.2，置于 4保存备用。7.1.5将待检血清用样品稀释液作 1:100 稀释，每孔加入 100 L，同时加入阴性对照和阳性对照血清各2 孔，每孔 100 L。置于 37 培养箱中反应 1 h。7.1.6重复步骤 8.1.2。7.1.7将抗猪 PRV 酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加入 100 L，置于 37 培养箱中反应 1 h。7.1.8重复步骤 8.1.2。7.1.9显色：每孔加入 100 L 底物显色液，轻柔摇匀，37 避光显色 10 min。7.1.10终止反应：每孔加入 100 L 终止液终止反应。7.1.11读数：在酶标仪上读取 450 nm 吸光值。7.2结果判定7.2.1在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD450），计算阳性对照平均 OD450值和阴性对照平均 OD450值。阳性对照血清平均 OD450值大于 0.6，阴性对照血清平均 OD450值小于 0.16，试验4SN/T 51962020成立。7.2.2当样品孔平均 OD450值（P）与阴性对照平均 OD450值（N）之比大于或等于 2.0（即 P/N 2.0）时，判定为 PRV 抗体阳性。7.2.3当样品孔平均 OD450值（P）与阴性对照平均 OD450值（N）之比小于 2.0（即 P/N 2.0）时，判定为 PRV 抗体阴性。8RT-PCR 方法8.1设立对照每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照为不含 PRV 的组织；阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液。8.2RNA 提取分别取 200 L 待检样品，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打 1020 次，室温放置 5 min；加入 200 L 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min；12 000 r/min 离心 15 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 放置 20 min；12 000 r/min 离心15 min；弃上清液，沉淀用 1 mL 75乙醇清洗；10 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥5 min；加 20 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。-20 冰箱保存备用，RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。空白对照、阴性对照和阳性对照进行同步操作。RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。8.3cDNA 合成8.3.1变性和退火反转录合成 cDNA 可选用等效的商品化试剂盒，下面以 Promega1）公司的反转录试剂盒（Reverse Transcription System）进行 cDNA 合成。在 200 L PCR 管中加入 10 L RNA 模板，70 孵育 10 min，短暂离心后置于冰上。8.3.2cDNA 合成在另一个 200 L PCR 管中加入 MgCl2 2.5 L、反转录 10 缓冲液 2.5 L、dNTP 2.5 L、重组的Rnasina 核糖核酸酶抑制剂 0.5 L、AMV 反转录酶 20 U、随机引物 1 L、RNA 模板 4 L，补充 DEPC水至 25 L。将反应体系在室温下温育 10 min，然后在 42 下孵育 60 min。反应结束后，95 5 min灭活反转录酶，冰浴 5 min。8.4PCR 扩增 DNA8.4.1反应体系普通 PCR 反应体系见表 1。PCR 扩增可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。1）使用 Promega 公司的反转录试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐 Promega 的产品，标准的使用人可以使用其他公司的同类产品。5SN/T 51962020表 1普通 PCR 反应体系名称储存液浓度终浓度加样量/L10PCR 缓冲液1012.5Taq DNA 聚合酶5 U/L0.1 U/L0.5dNTPs10 mmol/L0.2 mmol/L0.5上游引物 Cri-F110 mol/L0.4 mol/L1下游引物 Cri-R110 mol/L0.4 mol/L1cDNA2ddH2O17.5总体积25 注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。8.4.2反应条件将含有反应液的 PCR 管瞬时离心后，置于 PCR 仪。94 预变性 7 min；94 变性 30 s，56 退火 30 s，72 延伸 30 s，35 个循环；72 延伸 7 min；4 保存。8.4.3琼脂糖凝胶电泳用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖，加热完全溶解后，制成凝胶平板。待冷却后，取下梳子，将凝胶平板放入水平电泳槽，加入电泳缓冲液至充分没过凝胶面