SNT 4849.2-2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法 第2部分：树莓.pdf

SN/T4849.2-2017dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleoside triphosphate)dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate)dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracil N-glycosylase)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三羟甲基氢基甲烷Tris(Hydroxymethyl)aminomethane.EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene diaminetetraacetic acid).Taq:水生栖热菌(Thermus aquaticus)OD:光度密度(optical density)4方法提要果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA,果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA。以树莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在树莓成分。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1检测用引物和探针：树莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1。树莓引物扩增的靶标序列参见附录A。表1树莓序列引物探针扩增片物种名称引物/探针序列(53)靶基因段长度F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACANADH dehydrogenase内参照R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA138bpsubunit B(ndhB)geneP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F:GTTATTCGTTGGAACCGTAGGAANADH dehydrogenase树莓R:GACTGAAAAAACTGCATTTGTGA160bp(ndhF)geneP:FAM-ATTATCCAAATTGTTAACCCCGTCCATAAACCT-TAMAR5.2三氯甲烷（氯仿）。5.3异丙醇。5.4CTAB提取缓冲液：20g/L CTAB,1.4mol/LNaC1,0.1mol/L Tris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0.5.5CTAB沉淀液：5g/L CTAB,40mmol/L NaCl。,5.670%乙醇（体积分数）。5.7NaC1溶液(1.2mol/L)。2