SNT 4675.29-2016 出口葡萄酒中酒香酵母检验 实时荧光PCR法.pdf

SN/T4675.29-20167.2DNA提取7.2.1细胞裂解向收集的沉淀悬浮液中加入0.3g玻璃珠，然后加入PVPP,使其最终的质量/体积比为1%。加入200L溶液I和200L抽提液。涡旋振荡上述溶液80s,然后置于一20冷却80s;重复上述涡旋冷却步骤3次。7.2.2纯化DNA7.2.2.1加入200LTE溶液，12000g,离心5min。小心收集400L的上层水相至新的离心管中。如果水相和有机相分离不充分，重复上述离心步骤。7.2.2.2向离心管中加入1mL无水乙醇，颠倒混匀4次5次。15700g,离心5min,弃上清。7.2.2.3加入400uLTE溶液和30L浓度为14g/uL的RNaseA溶液，重悬沉淀。37温育5min。7.2.2.4加入10L浓度为4mol/L的醋酸铵溶液和1mL无水乙醇，颠倒混匀。7.2.2.512000g,离心5mi,弃上清。倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同位置吸干。7.2.2.6沉淀干燥：打开离心管盖，48恒温干燥1h。7.2.2.7向干燥后的离心管底部加人25LTE,涡旋震荡后于4放置1h18h(帮助DNA溶解)。室温下测定DNA含量。当DNA浓度为0.34g/mL340g/mL,A6o/A2比值在1.71.9之间时，适宜PCR扩增。注：可使用等效商品化DNA提取试剂盒，按照操作说明书制备DNA模板。7.3阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：采用不含目标基因序列的菌株DNA为模板，每个反应板至少设置1个阴性对照。阳性对照：接种酒香酵母到10mLYM培养基中，30培养24h,取1mL菌液提取DNA模板，作为阳性对照，每个反应板至少设置2个阳性对照。设两个空白对照：一提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）：RT-PCR反应的空白对照（以TE溶液代替DNA模板）。7.4RT-PCR反应体系RT-PCR反应体系见表2。每个样品各做2个平行孔。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，密封反应板或联排管。密封后，可对反应板或联排管进行短时间离心以除掉其中的气泡。表2实时荧光PCR反应体系试剂名称试剂用量/L10XPCR反应缓冲液2.5MgC2溶液(25mmol/L)3.0dNTP(10 mmol/L)1.0上游引物(10mol/L)1.0下游引物(10mol/L)1.03