SNT 4624.6-2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌.pdf

SN/T4624.6-20164.5PCR扩增仪。4.6实时荧光PCR仪。4.7微量移液器和灭菌吸头：10L、20L、200L、1000L。4.8高压灭菌锅。4.9PCR超净工作台。4.10电泳仪。4.11核酸/蛋白分析仪。4.12凝胶成像系统。4.13无菌培养皿：直径90mm。5样品制备以无菌操作取1g(mL)样品加入到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加入到225mL灭菌生理盐水中混匀。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。6形态学及生化鉴定6.1增菌从上述样品匀液中取25mL加入到225mL的7.5%氯化钠肉汤的均质袋中混匀，于361培养18h24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36士1培养l8h24h。Baird-Parker平板36士1培养18h24h观察记录菌落特征，必要时可将培养时间延长至45h48h。6.2分离金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm3mnm,颜色是灰色到黑色，边缘为谈色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。6.3染色、镜检染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约为0.5m14m。6.4血浆凝固酶试验挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，361培养18h24h。取新鲜配置兔血浆0.5mL,放人小试管中，再加入BH1培养物0.2mL0.3mL,振荡摇匀，置于36士1恒温箱或水浴箱内，每30min观察一次，观察6h,如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI,36士1培养18h48h,重复试验。2