SNT 4419.5-2016 出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法 第5部分：杏仁.pdf

SN/T4419.5-2016表1引物序列名称编号序列外侧上游引物(F3)5-GTTGCCCAAAGAACGTGAACAA-3外侧下游引物(B3)5-GGTCCACCTTTGCATGTAAATGTACC-35-TTGAGGCGGAGTGCAACAGTGCT内侧上游引物(FIP)TGAAAGGGGCCAATGGGAAAG-3LAMP引物序列5-CAACACTCCAGAGACATGCCCACC内侧下游引物(BIP)AGCGTTGAGGCATGCGTGACT-3上游环引物(FLP)5-CTTTGGCTCTTGGAATGCGACAC-3下游环引物(BLP)5-ACCGACAAAGTACCCTCAGATATTCAG-36.4DNA提取6.4.1称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加入1 mL CTAB提取缓冲液和10L蛋白酶K,651h,期间每隔10min振荡混匀。6.4.212000g离心10min,吸取上清液700L至一新1.5mL离心管中。6.4.3加入490uL三氯甲烷，振荡混合后，12000g离心10min。6.4.4吸取500L上清液至一新1.5mL管中。6.4.5加入2倍体积CTAB沉淀液，混匀后室温静置60min,12000g离心10min。6.4.6弃去上清液，加人350L1.2mmol/LNaC1溶液充分溶解沉淀。6.4.7加入350L三氯甲烷，高速漩涡振荡混匀，12000g离心10min。6.4.8吸取上清液至一新1.5mL管中，加入0.8倍体积异丙醇，混匀，一20静置20min,12000g离心10min。6.4.9弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min。6.4.10弃去上清液，晾干，加入100LTE缓冲液，溶解DNA沉淀，一20保存备用。6.5检测步骤6.5.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。设两个空白对照：提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）：LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）。6.5.2杏仁LAMP反应体系LAMP反应体系见表2。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进人反应液中。3