SNT 4419.17-2016 出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法 第17部分：荞麦.pdf

SN/T4419.17-20165方法提要样品经研磨后，提取DNA,以DNA为模板，采用荞麦过敏原蛋白基因特异性检测引物进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在荞麦成分。6LAMP检测方法6.1原理根据荞麦过敏原蛋白基因序列设计内引物、外引物各一对，特异性识别靶序列上的6个独立区域。在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链。由于内引物与相邻区域存在互补区，游离的内引物合成链折叠成茎-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结构DNA。加入显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果。DNA聚合反应析出的焦磷酸根离子与溶液中的Mg2+结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系中的dsDNA的量。6.2仪器和设备6.2.1超纯水发生器（分子生物学级别）。6.2.2水浴锅或加热模板：651和801。6.2.3离心管：0.1mL、1.5mL。6.2.4计时器。6.2.5移液枪：量程0.5uL10L、量程10L100L、量程100L1000L。6.3试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2CTAB提取缓冲液(20g/L CTAB,1.4mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA,pH8.0)。6.3.3CTAB沉淀液(5g/L CTAB,40mmol/L NaCl).6.3.4NaC1溶液：1.2mmol/L6.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。6.3.6 dNTPs溶液：每种脱氧核糖核苷酸浓度10mmol/L。6.3.7 Bst DNA聚合酶：酶浓度8U/uL。6.3.810Thermol Pol缓冲液：含200mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%Triton X-100.6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L。6.3.10甜菜碱溶液：5mol/L。6.3.11显色液：SYBR Green I荧光染料，1000。2