SNT 4169-2015 扁浒苔检疫鉴定方法.pdf

SN/T4169-2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国青岛出入境检验检疫局、宁波象山旭文海藻开发有限公司、宁波大学。本标准主要起草人：段维军、郭立新、庞国兴、朱文荣、徐年军、张慧丽、顾建锋、张永江、陈炯、陈长法、陈先锋、朱水芳。ISN/T4169-20154仪器和用具4.1仪器显微镜、超净工作台、人工气候箱、天平、高压灭菌锅、PCR仪、电泳系统、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、普通冰箱。4.2用具盐度计、光照计、烧杯、三角瓶、量筒、试管、玻璃培养皿（直径9cm)、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、载玻片、盖玻片、可调移液器(0.L2L,1L一10L,10L100L,100L1000L)及相应的吸头、离心管、PCR管和研钵5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、TaqDNA聚合酶、引物、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、氯化钠(NCI)、三羟甲基氨基甲烷盐酸、冰乙酸、津化乙锭、乙醇、火菌海水、灭菌水、蒸馏水。6鉴定方法6.1分离培养采用断藻法进行分离，将疑似石莼属绿漢用无菌水冲洗3次后，用无菌刀片切割成长度为1mm2mm的小藻段，置于盐度调整为20的灭菌海水玻璃培养皿中，20培养，12h光照/12h黑暗，培养10d.6.2形态观察从海水样品、其他采集样品或分离培养获得纯培养物，使用无菌镊子等分离工具，挑取出藻体进行形态学观察与PCR检测。6.3PCR检测方法试剂配制见附录D,PCR检测方法见附录E。7鉴定特征7.1形态学鉴定特征扁浒苔藻体柔软，常漂浮于岸边，多从下部开始分枝，上部少，下部细上部宽，分枝处多缢缩，下部节状，藻体中气泡多，管状、中空；基部区具有狭窄翼；细胞排列不规则，46边形，有时呈小圆圈状排列叶绿体有时呈帽状分布于细胞中（参见附录B和附录C)。7.2PCR鉴定若阴性对照和空白对照正常，待检样品经过PCR扩增后电泳在330bp出现特异性片段，则判定为阳性。2SN/T4169-20158结果判定若分离物的培养特征与7.1相符，可初步判定为检出扁浒苔，需利用7.2方法进一步检测。若PCR凝胶电泳检测结果为阳性，而且扩增片段大小与描述相符，可判定为扁浒苔。9样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出扁浒苔的样品应保存于4冰箱中，保存期为1年，有特殊需求保存期可延长，以餐复验、谈判和仲裁。保存期满，应经高压灭菌后方可处理。10菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为扁浒苔的藻株，应妥善保存。将藻株接种于盐度调整为20的灭菌海水，20培养96h,然后4冰箱保存，或将培养好藻株置于一80长期保存。对不需要长期保存的藻株应及时高压灭菌处理。11结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。