SNT 3584-2013 草鱼出血病检疫技术规范.pdf

SN/T3584-20137.2采样部位送检鱼到达实验室时应是活的。如是体长4cm的鱼苗取整条鱼，但如有卵黄囊则需除去；体长4cm6cm的鱼苗取包括肾和脑在内的所有内脏；体长6cm的鱼则取肝、脑、脾、肾。每5条鱼可以合并为一个小样。8病毒的分离8.1样品处理先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再用培养液按1：10的最终稀释度重悬于含有10001U/mL青霉素和1000g/mL链霉素的培养液（见附录C.2)中。于25C下孵育2h4h或4下孵育过夜，以释放病毒。8000g离心20min,收集上清液。8.2病毒接种与观察对1：10的组织匀浆上清液再作两次1：10的稀释，然后将这1：10、1：100和1：10003个稀释度的上清液接种到生长约24h的CIK或者CO细胞单层的96孔板中，每孔接种100L稀释液。吸附1h后，加入细胞培养液。置于252培养。试验中要有2孔阳性对照（接种GCRV-873株）和空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍100倍倒置显微镜检查。空白对照细胞形态应保持正常。如果阳性对照细胞出现了CPE,当接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现CPE时，应立即进行鉴定。如果没有CPE出现，则在培养7d后还要再盲传一次，然后进行鉴定。盲传时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以8000g,4离心20min,收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，每孔接种100L。继续置于252培养7d。每天用40倍100倍倒置显微镜检查如果阳性对照也未出现CPE,则应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。9病毒的鉴定9.1RT-PCR检测9.1.1样品处理将450uL细胞悬液放入1.5mL的离心管，再加入450LCTAB溶液（见附录C.3)并混匀。25作用2h2.5h。9.1.2RNA抽提在含有样品的离心管中加入600L抽提液2（见附录C.5),用力混合至少30s。12000r/min离心5min,小心取上层水相（约800 L)。再加入700 L抽提液1（见附录C.4),用力混合至少30 s。12000r/min离心5min,小心取上层水相（约600L)。再加入20预冷的1.5倍体积的无水乙醇(约900L),倒置数次混匀后，-208h以上沉淀核酸。12000r/min离心30min,小心弃去上清液。干燥后加11L水溶解，用作PCR模板。也可以用其他的抽提RNA的方法或者采用相应的试剂盒来抽提病毒核酸。3