SNT 4103-2015 猪及其加工产品中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

SN/T4103-2015设计见表1。将合成的引物加入无离子水配成100pmol/L贮存，配成直接用于PCR反应的10pmol/L的工作液。表1检测转基因动物内外基因所需的引物序列被检测基因基因来源引物序列扩增片段长度/bp备注5GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA3猪mtDNA内源212内对照5ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG35CCGAAGGTTCAGGTTTACTC3猪M内源217内对照5ACTGATCCACAGCGTTAGG35GAGATCAGCAGCCTCTGTTCC3MSTN基因敲除MSTN外源6195AGCCTATTGAATTAGCACCATTGG3猪检测5GATGTGAAGAGCGAAATGC3转植酸酶基因APPA外源2655ACACCTACTCAGACAATGC3猪检测转-3脂肪酸5GGCTTCTGGCGTGTGACC3Sfat-1外源171去饱和酶基因5GTGGCGGATAACCCTTCTGAG3检测4.2其他试剂TaqDNA聚合酶，琼脂糖（电泳纯），三氯甲烷（氯仿），异丙醇，异戊醇，70%乙醇，DL2000Marker(100bp2000bp),TE缓冲液，50倍TAE电泳浓缩缓冲液，动物组织裂解缓冲液，蛋白酶K,醋酸钠(NaAc)。试剂配置见附录A。5仪器5.1PCR仪。5.2凝胶成像系统。5.3核酸蛋白分析仪。5.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。5.5电泳仪。6检测方法6.1样品DNA的提取与纯化6.1.1取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。液氮研磨后转人1.5mL离心管中，加入1mL的组织裂解缓冲液，加入蛋白酶K(20mg/mL)和胰RNA酶(20mg/mL)各5L,混匀。在65C恒温水浴锅中水浴30min,也可转人37水浴12h24h,间歇振荡离心管数次至充分消化。在台式离心机上以12000r/min离心5min,取上清液转入另一离心管中。6.1.2加等量的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)至上清液中，振荡混匀，12000r/min,离心5min。6.1.3取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，振荡混匀，12000r/min,离心5 min。6.1.4取上层溶液至另一管，加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2),加入2倍体积的无水乙醇，混2