SNT 3767.29-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第29部分：甜菜H7-1品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.2-2014等第出口食品中转基因成分环介导温扩增(LAMP)检测方法29部分:甜 菜H7|、1品 系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 29 Sugarbeet H7-12 0 1 0 卜 1 3 发布 14-0B-01实施国局和啪土咖民骷人眺华颏中国发布sN/T3767.29-2014亠一一日亠刖SN/T3767出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3 部分:玉 米B t-1 1 品系;第4 部分:玉 米B t 1 7 6 品系;第5部分:玉 米GA21品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第J 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米孓25品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;、第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 铞品 系;第1 8 部分:大豆G T 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻B 63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第2 4 部分:水稻L L R I C E 6 2 品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小 麦B 7 3 6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第29部分。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和 国上海 出人境检验检疫局、中华人 民共和 国吉林 出入境检验检疫局、中华人 民共和国广东出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:张 舒亚、李 晓虹、刘金华、李 富威、吕蓉、李想、谌鸿超、宋青、高东微、李志勇、石磊。sN/T3767,29-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第29部分:甜 菜H7-1品系1 范围SN/T3767的本部分规定 了甜检测方法。本标准适用于甜菜及其制品中本方法的定性检测低限为0,5%(质量分数)。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是,仅 注 日期的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,其文件。GB/T6682 分析实验室用水G B/T 1 9 4 9 5,2 转基 因 产 品 检 测G B/T 1 9 4 9 5,3 转基 因 产 品 检 测实验室技术要提取纯G B/T 1 9 4 9 5.7 转基 因 产 品 检不 口 帝 刂S N/T 3 7 6 7,2 1 4 出口食成MP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5,3 的规定执行。6 LAMP检测 方法6,1 原理6.1.1 一般原理根据转基 因甜菜H7-1品系外 源基 因和甜菜边界序列设计 特异性 内引物、外 引物 和环 引物各一对,1环介导等温扩增(LAMP)初筛检测。sN/T3767,29-2014特异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应,在 甜菜H 1品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6,1,2 显色液显色原理SYBR Gmen I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6,2,2 水浴锅或加热模板:6 3,0 0,5 和8 0.0 0,5。6,2,3 离心管:0,1 m L、1,5 m L。6,2.4 移液器:量 程0,5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u I 。6,2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3,1 实验用水:应符合G B/T 6 6 8 2 中一级水的规格。、6.3,2 dNTPs溶液:每 种核苷酸浓度10mmol/L。6.3,3 B s t D N A 聚合 酶(如:N E B 公司 或 具 有 同 等 效 果 的D N A 聚合 酶):酶浓 度8 U/u L。6,3,4 1 0 T h m l P o l 缓冲 液:含 0 m m o l/L T H C l(p H 8.8)、1 0 0 m m o l/L 硫酸 铵、1 0 0 m m o l/L氯化钾、z O m m o l/L 硫酸镁、1%T r o n 1 0 0。6.3.5 硫酸镁溶液:1 5 0 m m o l/L。6.3.6 甜菜碱:5 m o l/L。6.3.7 显色液:S Y B R G r e e n I 荧光染料,1 0 0 0。6.3,8 引物:根 据转基因甜菜H 1品系外源基因和甜菜边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2,环引物1和环引物2。外引物扩增片段长度:237bp夕 卜 引 lnJ1(F3,5,3):AACACTTAGCTTGGGACAA夕 卜 引 姥 勿2(B3,5-3):TGATTGAACCCAATCTGGA内 弓u吻1(FIP,5,-3):CCG纹 ATGAGAAGAGAGAAACATCATATTTCTTAATTTTTGCAGGCGA内 引+nJ2(BIP,5-3):TCTGGGTGGCTCTAACTATTTACATTTTCTCAAGCTTGATGGGGAT环 引 物1(FLP,53):AACACAAAATGCTCATAACAGCCAC环引物2(BLP,5-3):CTGAAGGCGGGAAACGACAA6,4 检测步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1,1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6,4.1.2 阳性对照:2sN/T3767,29-2014采用含有待测基因序列 的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1,3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以 水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4,2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照 SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4.3 甜菜H7-1品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表1 甜菜H71品系LAMP反应体系6,4.4 LAMP反应参数6 3,0 o.5 恒温扩增6 0 m i n,8 0.0 0,5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6.4,5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6,5,2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。组 分工作液浓度力 口 样量/lL反应体系终浓度T h e r m l P 1 缓冲液102,5l夕 卜 狈 刂 L游弓 H勿(F3)10 pmol/L0,50.2 u m o l/L夕 卜 狈 刂 下游弓 H勿(B3)10umo1/L0 2um l/L内侧上游引物(FIP(F1c+F2)40umo1/I1.016um l/L内侧下游引物(BIP(B1c+B2)40umo1/L1,01 6 u m l/L环 引 物1(FLP,5冫3)40umol/L0.B pmol/L环 引 物2(BLP,5-3)40uml/L0.508uml/LdNTPs10mml/L41,6mmo1/L甜菜碱5mol/L40,8mol/L硫 酸镁150mmol/I16nnrnol/LBs矽DNA聚合酶8U/uL10,32U/uLDNA模板700 ng/pLB ng/pL水补足至 25,0sN/T3767,2920146.5.3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。6.5,4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管 中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因甜菜H 1品系初筛阳性,还 应通过对外引物PCR扩增产物的序列测定进行确证(见 附录A)。8 结 果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该8,2 检测结果为转基因甜菜H7-1验情况进行结果判断和表述。卜|sN/T3767,29-2014附 录 A(资 料性 附录)转基 因甜菜H7-1品系基 因序 列A。1 转基 因甜菜H71品系外源基 因和甜菜边界序 列AAGCT GcTTGGGAG气八 ACTTCTG丿叮CC咖CGCAGGcG胛GGTGGCTGT叮GAGCArTTTGTGTTTG护GTTTCTCTCTTCTG吼CGG啊GGG股 TGGGtGGCTCATTTACATGAATCTGATCCCCATCAAGCTTGAGCTCAGGATTTAGCAA。2 引物碱基序 列及构成F3:AACACTTAGcTTGGGAcAB3:TGATTGAACccAATCTCCGTAATGAGAAGTTAATTTTTGCAGGCGAB2CAAGCTTGATGGGGATFLP:AACACAAAATGCTCAT山CAGCCBLP:CTGAAGGCGGGAAA 寸一0丨卜z中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第部分:甜 菜H7-1品系sN/T3767,292014中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝 阳区和平里西街 甲2号(100029)北京市西城 区三里河北街16号(100045)总 编 室:(0 1 0)6 8 5 3 3 5 3 3网址 w w w,s p C,n e t,c n中 国标 准 出版社 秦 皇 岛 印刷 厂 印刷开本88012301/16 印张0.75 字数10千字14年12月第一版 14年12月第一次印刷印数1-1