SNT 3767.2-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第2部分：筛选方法.pdf

SN/T3767.2-2014Triton X-100:聚乙二醇辛基基醚dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸4防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。5抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行6核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。7LAMP检测方法7.1原理7.1.1一般原理根据转基因植物外源基因和内源基因序列设计特异性内引物和外引物各一对或者添加一条或一对环引物，本标准所涉及的目标基因序列参见附录A。所设计的引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bs聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。7.1.2显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。7.2仪器和设备7.2.1超纯水发生器。7.2.2水浴锅或加热模板：63.00.5和80.00.5。7.2.3离心管：0.1mL、1.5mL。7.2.4移液器：量程0.5L10L;量程10L100L;量程100L1000 L。7.2.5计时器。7.3试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。2