SNT 3767.6-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第6部分：玉米MIR162 品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767,-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第6部分:玉 米MIR162品系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 6:Maize MIR16214-013发布 1408-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T3767,6-2014亠一一回亠刚SN/T3767出口食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt-11品系;第4 部分:玉米B t 1 7 6 品系;第5部分:玉 米GA21品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米T-25品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大 豆A 2 7 0 4-1 2 品系;、第1 6 部分:大 豆A 5 5 4 7-1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 品 系;第1 8 部分:大豆G T 泓 0 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第20部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第2 4 部分:水稻L L R E E 6 2 品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小麦B 7 3-6 1 晶系;第29部分:甜 菜H 1品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第6部分。本部分按照GB/T1,1-2009给出的规则起草。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共 和 国厦 门出人境检验检疫局、中华人 民共 和 国广东 出人境检验检疫局。本部分主要起草人:陈 双雅、刘津、高东微、李志勇、王嘉鹤、陈伟玲、王群力、谢 明星、刘棠、彭小莉、许秋贝。出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第6部 分:玉 米MIR162品系1 范围SN/T3767的本部分规定了转方法。本部分适用于玉米 中转基 因玉本方法的定性检测低限为0.5%(质量分数)。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是件。凡是不注 日期的引用文件,其 最GB/T6682 分析实验室用水G B/T 1 9 4 9 5.2 转基 因 产 品 检 测G B/T 1 9 4 9 5.3 转基 因 产 品 检 测实验室技术要取 纯G B/T 1 9 4 9 5,7 转基 因 产 品 检芾 刂S N/T 3 7 6 7.2 1 4 出口食成选方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件3,1 a d h 1:玉米乙醇脱氢酶1(a l h4 防污染措施)基 因环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495,2的规定。5 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。6 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。sN/T3767,62014导等温扩增(LAMP)初筛检测,仅 注 日期 的版本适用于本文文件。MP)检测方法第2部分:筛sN/T3767.6-20147 LAMP检测方法7,1 原理7,1.1 一般原理根据转基 因玉米MIR162品系外源基 因和玉米边界序列设计特异性 内引物和外引物各一对,特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,在 反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bs莎聚合酶的作用下启动循环链置换反应,在 玉米MIR162品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环 的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。7.1.2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。7,2 仪器和设备7.2.1 超纯水发生器。7.2,2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0,5 和8 0.0 0.5。7,2,3离Jb管:0.1mL、1.5mL。7,2.4 移液器:量程0,5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。7.2.5 计时器。7,3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。7.3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。7,3,2 d N T P s 溶液:每种核苷酸浓度1 0 m m l/L。7,3.3 Bs莎DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。7,3.4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液:含2 0 0 m m o l/L T o s H C l(p H 值为8,8)、1 0 0 m m o l/L 硫酸铵、1 0 0 m m o l/L 氯化钾、2 0 m m o l/L 硫酸镁、1%T。t o n 1 0 0。7,3,5 硫酸镁溶液:1 0 0 m m o l/L。7,3.6 甜菜碱:5 m。l/L。7.3.7 显色液:S Y B R G r e e l I 荧光染料,1 0 0 0。7.3,8 引物:根 据转基因玉米MIR162品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:214bp夕卜 引物1(F3,5-3):TGATTAGAGTCCCGCAATT夕 卜 引 物2(B3,53):TCATACAAAAAGGCCCAGT内 引 物1(FIP,5-3):AACATAGATGACACCGCGCG-GCGATAGAAAACAAAATATAGCG内 引 彬 勿2(BIP,5-3):ATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCC-AAAACAACTACCACAAGGC2sN/T3767.6-20147,4 实验步骤7,4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置7,4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。7,4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。7,4.1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品):LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。7,4,2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表 明从样 品中提取的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767,2-2014的规定进行。7.4,3 玉米M I R 1 6 2 品系L A M P 反应 体 系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表1 玉米M I R 1 6 2 品系L A M P 反应 体 系7.4.4 LAMP反应参数6 3,0 o.5 恒温扩增9 0 m i n,8 0,0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。7.4.5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。组 分工作液浓度力 口 本 莘 鹰 鳘/uL反应体系终浓度T h e r m o P o l 缓冲液1夕 卜 引物1(F3)10umo1/L0.50,2uml/L夕 卜 引4勿2(B3)10umol/L0.2umol/L内引物1(FIP)40umol/L1.6 u m o l/L内引物2(BIP)40 prrol/L1.6umol/LdNTPs10mmol/L41.6mmol/L甜莱碱5mol/L40.8mmol/L硫酸镁1 0 0 m m o l/L6mm l/LB s 砂D N A 聚合酶8U/uL10,3 2 U/u LDNA模板100 nglgl2B ne/pL水补足至 25.0sN/T3767.6-20147.5 质量控制7.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。7,5,2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。7,5,3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。7.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。8 结果判断和确证8.1 待检样 品2个平行样反应管果为阴性。8.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1转基因玉米MIR162品系初筛阳性,还 应通过下按照欧盟的方法(CRLVL08/08V可对外引物PCR扩增产物氵其他验证方法。9 结果表述果正常,可 判断该样 品检测结对照结果正常,可 判断该样 品证(见附录A):检测;系”。情况进行结果判断和表述。9.19.2检测结果为阴性,表 述为“该样 品未转基因检测结果为转基因玉米MIR16伢 爷 阳sN/T3767.6-2014附 录 A(资 料性附录)转基因玉米MIR162品系基因序列A。1 转基因玉米M I R 1 6 2 品系特异性基因序列(a c c e s s i o n n o。H I 2 0 3 3 4 9)(夕卜 引物扩增长度:2 1 4 b p)TGAT TAGAGTCCCG cAATTATACA TTTAATACGC GATAGAAAACAAAATATAGc GCGcAAACTA GGATAAATTA TCGCGCGCGG TGTCATCTATGTTACTAGATAA AACGTCCGCCATGGTCTGAA GGCAAcTG GTAGTTGTTTTACTGGGCCT TTTTGTA.2 引物 序 列及 构 成F3:TGATTAGAGTccCGCB3:TCATACAAAAAGGCF1cFIP:AACATAGATGACAATATAGCGB1cBIP:ATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCc=CTACCACAAGGC寸冖0丨卜zsN/T中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第6部分:玉 米MIR162品系sN/T3767.6-2014中 国 标 准 出 版 社 出 版北 京市 朝 阳 区和平 里西街 甲2号(100029)北京 市西 城 区三里河 北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址w w w。s p C.n e t,c n中 国标 准 出版社 秦 皇 岛 印刷 厂 印刷开本88012301/16 印张0.75 字数12干字2 0 1 4 年 1 1 月第一版 2 0 1 4 年1 1 月第一次 印 刷印数1-1300书 号:1