SNT 3767.23-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第23部分：水稻KMD1品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.2-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法ffi 23 Fllr|,/(fE KMD FafrLoop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Paft 23:Rice KMD2014-013发布 14-0B-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布sN/T3767,23-2014亠刖亠一一回SN/T3767出口食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt-11品系;第4部分:玉 米Bd76品系;第5 部分:玉 米G A 2 1 品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米T25品系;第13部分:玉 米3272品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;第1 6 部分:大 豆A 5 5 4 7-1 2 7 品系;、第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T 泓 0 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;/第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2Al品系;第2 8 部分:小 麦B 7 3-6 1 品系;第29部分:甜 菜H 1品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第23部分。本部分按照GB/T1.109给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和 国珠海 出入境检验检疫局、中华人 民共和 国广东 出入境检验检疫局、中华人 民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人 民共和国北京 出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部本主要起草人:邝 筱 珊、王小玉、刘李登、冯家望、李 志勇、曾静、薛 峰、胡松楠、游 淑珠、陈敬、常彦磊。出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第23部分:水 稻 MD品系sN/T 3767,23-2014品系特异性的环介导等温扩增定性检测。1 范 围SN/T3767的本部分规定了(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于水稻及其加工本方法的定性检测低限为0,5%(质量分数)。2 规范性 引用文件下列文件对于本文件的应用,仅 注 日期的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,其本文件。GB/T6682 分析实验室用水G B/T 1 9 4 9 5.2 转基 因 产 品 检G B/T 1 9 4 9 5.3 转基 因 产 品 检 测提取和制G B/T 1 9 4 9 5.7 转基 因 产 晶 检S N/T 3 7 6 7,2 1 4 出口食因 成AMP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基 因水稻KMD品系外源基 因和水稻边界序列(参 见附录A)设计特异性 内引物和外引物各1sN/T3767.23-2014一对,特 异性识别 目标序列上的六个独立区域,在 反应缓冲液 中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bs莎聚合酶的作用下启动循环链置换反应,在 特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶 的抑制剂。在设置合适对照和在检测下 限的情况下,定 性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。6,1.2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌入方式结合到双链DNA的 小沟内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2,2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0.5 和8 0.0 0.5。6.2.3离心管:0.1mL、1.5mL。6,2,4 移液 器:量程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 d N T P s 溶液:每种核苷酸浓度1 0 m m。l/L。6.3,3 Bs莎DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6.3.4 10ThermdPol缓 冲液:含0mmol/L Tro-HCl(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmd/L氯化钾、mmol/L硫酸镁、1%Triton 100。6.3,5 硫酸镁溶液:150mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6,3,7 显色液:SYBR Green I荧 光染料,1000。6.3.8 引物:根 据转基因水稻KMD品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:278bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):GGAACAACACTCAACCCTATC夕 卜 引 物2(B3,5-3):GCCCATCTCGGGATATATTGT内 引 物1(FIP,5-3):GCCCCAGCAGGCGAAAATCATTTTGCCGATTTCGGAACCA内 引 物2(BIP,5-3):AGGCGGTGAAGGGCAATCAAATAACACATTGCGGACGT6,4 实验步骤6.4,1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1,1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2sN/T 3767.23-20146,4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4,1,3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基 因检测,结 果阳性则表 明从样品中提取的DNA,可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照本SN/T3767.214的规定进行。6.4.3 水稻MD品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表 1 水 稻KMD品系 LAMP反应体系6.4.4 LAMP反应参数6 3,0 o.5 恒温扩增9 0 m i n,8 0.0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6,5.2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6.5,3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。组.分工作液浓度力 口 准 莘 遣 鳘/uL反应体系终浓度T h e r m l P o l 缓冲液2.51夕 卜 引爿 勿1(F31 0 u m l/L02um l/L夕 卜 引彬 2(B3)10uml/L0,50 2umol/L内引物1(P)40umol/L1.016umo1/L内引物2(BIP)40umol/L1.o16umol/LdNTPs1 0 m m I/L41.6 m m l/L甜菜碱5moI/L51mol/L硫酸镁150mmo1/L16mm l/LB s 扌D N A 聚合酶8U/uL10,32U/uLDNA模板100ng/uL2B ns/pL水补足至 25.0sN/T3767.23-20146.5.4 阳J眭对照:反 应管 中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管 中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果为阴性。7,2 待检样品2个平行样反应管 中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因水稻KMD品系初筛阳性,应 通过对外引物PCR扩增产物的序列测定进行确证(见 附录A)。8 结果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该8.2 检测结果为转基因水稻K验情况进行结果判断和表述。sN/T3767,23-2014附 录 A(资 料性附录)转基因水稻MD品系基因序列A。1 转基因水稻 M D 品系外源基因和水稻边界序列(A c c e s s i o n n o。E U 9 8 0 3 6 3.1)GGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTCTTTTGAT 吼 AGGGATTTTGCCGATTTCGGAACCAC波 CAAAGAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCATTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAATGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTGATTTGTTTAA,2 引物碱 基序 列及构成F3:GGAACAACACTCAACCB3:GCCCATCTCGGGATAF1c261121181241FIP:BIP:GCCCCAGCAGGCGAB1cAGGCGGTGAAGGGCAAGAACCA寸冖0丨宀卜z中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食 品 中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第23部分:水 稻MD品系sN/T3767.23-201在中 国 标 准 出 版 社 出 版北 京 市朝 阳区和平 里 西街 甲2号(100029)北京 市西 城 区三里河 北街16号(100045)总 编室:(010)68533533网址w w w。s p C。n e t,c n中国标准 出版社秦皇岛印刷厂印刷开 本8 8 0 1 2 3 0 1/1 6 印张.7 5 字数1 0 千字zO14年12月第一版 14年12月第一次印刷印数11300书 号:1 5 5 0 6 6 2 7 4 7 7 定价1 6,0 0 元sN/T 3767,23-2014