SNT 3767.14-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第14部分：玉米59122品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.142014出口食品中转基因成分环介导#tffi+r rg(LAMP)f0 ifll|fr i*ffi 14 frtr|,:EiK 5e122 ffi eLoop-mediated isothermat amplification detection method for geneticatlymodified?Hil:fi;i:1 for export-14-0卜13发布14-OB-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布sN/T3767.14-2014亠一一曰亠刖SN/T3767出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt11品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5部分:玉 米GA21品系;第6部分:玉 米MIR162品系;第7部分:玉 米MIR604品系;第8部分:玉 米MON810品系;第9 部分:玉 米M o N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米25品系;第13部分:玉 米3272品系;第14部分:玉 米59122品系;第1 5 部分:大 豆A 2 7 0 4-1 2 品系;第16部分:大豆 A554727品系;第17部分:大豆DP356043混系;第18部分:大豆 GT 3乇品 系;第19部分:大豆 MON89788品系;第zO部分:水 稻B 63品系;第21部分:水 稻 KF6品系;第22部分:水 稻 KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;第2 5 部分:水 稻M 1 2 品系;第26部分:水 稻T1 19品系;第27部分:水 稻T2肛 1品系;第2 8 部分:小麦B 7 3-6 晶系;第29部分:甜 菜H 1品系;第3 0 部分:油菜R T-7 3 品系。本部分为SN/T3767的第14部分。本部分按照 GB/T1.109给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。本部分起草单位:中 华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人 民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:贺 艳、陈其勇、刘伟、付伟、张裕君、郑文杰、陈颖、邝筱珊、李志勇、常彦磊。sN/T3767.14-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第14部分:玉 米 59122品系1 范围SN/T3767的本部分规定了玉米中转基因玉米59122品系特异性的环介导等温扩增(LAMD初筛检测方法。本部分适用于进出口玉米及初加工产品中转基因玉米59122品系特异性 的定性检测。本方法的定性检测低限为1.0%(质量分数)。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注 日期 的引用文件,仅 注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期 的引用文件,其 最新版本(包 括所有 的修改单)适 用于本义件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2 转基 因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3 转基 因产品检测 核酸提取纯化方法GB/T19495.7 转基 因产品检测 抽样和制样方法SN/T3767.214 出口食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因玉米59122品系外源基因和玉米边界序列(参 见附录A)设计特异性 内引物、外引物和1sN/T3767.14-2014成环引物各一对,特 异性识别 目标序列上的六个独立 区域,利 用Bs彦酶启动循环链置换反应,在 玉米 品系59122特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mgz+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子,未 发生反应时锰离子与钙黄绿素结合,钙黄绿素的荧光被淬灭,呈 现橙色。当扩增反应发生时,扩 增过程中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结合,形 成不可逆的沉淀物,将 锰离子从钙黄绿素上释放下来,从 而使钙黄绿素恢复荧光,同 时体系中的镁离子与钙黄绿素结合,进一步加强钙黄绿素的荧光,可 在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光,颜 色也 由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.16.2.26.2.36.2.46.2.5超纯水发生器。水浴锅或加离心管:0.移液器:计时器6.3 试剂和除另有6.3.1 实验6.3.2 dNT6.3.3 Bs纟6.3.4 10100mmol/L6.5 硫酸镁6.3.6 甜菜碱:56.3.7 显色液:钙 黄6.3.8 引物:根 据转基性引物,包 括外引物1、外引物2、内引物1、内引外引物扩增片段长度为9外 引 物1(F 3,5 七):C G A A C G A夕 卜 引 角 勿2(B3,5-3):TTGCGGTTCTGTCAGTTC内 弓u勿1(FIP,5,-3):CCTTCACTCTTTCTTCCGTCCCTTCTCGTACTCACCAACATTG内 弓卩 勿2(BIP,5-3):TTAAACTGAAGGCGGGAAACGAGTCATAACGTGACTCCCTTAA环 引+9/J1(FLP,5-3):TGAGCCAATCACAGGTGC环 引 物2(BLP,5-3):CAATCTGATCATGAGCGGAGA6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:2 0.5 和8 0。0 0.5。,0.312mol/L。系外源基 因和玉米边界序列sN/T3767.14-2014采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板。6.4.1.3 设两个空白对照:提取 DNA时设置的提取空白对照(以 水代替样品);LAMP反应的空白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测,结 果阳性则表明从样品中提取的DNA可 以进行外源基因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照 SN/T3767.2zO14的规定进行。6.4.4 LAMP反应参数6 3.0 士0.5 恒温扩增9 0 m h,8 0.0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反 应结束。6.4.5 显色反应反应结束后,立 即将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,在 黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果.4.3 59122弘 系LAMP反应体老 全加人反应液时应小心,防 止 尸 嘤 黛 麝 殇显色液混合进人反伍液做2个平行L系配制完成后,将1u显色液表1 玉米sg122品系LAMP反应体系酊分卩 叮d F1威、体 系 终 浓 度LTherrr卜 o1射肺 液1夕 卜 l物1FPm叫 F pmol/L夕 卜物-10um7Jpmol/L内 钐 1IP)-40uml1pmol/L内弓勿2CEP)冂1pmol/Lrf Etl1(Fl匚uml/LrctvJeh/J+vmot/L焖10mmol/L碴J 6 m m d/L甜 菜 碱 、5md/L4 t 0.8 mmol,/L硫酸镁 冂Q、,150。nmd/L6mmol/LB踮DNA聚合酶 垭Lo,32U/uLDNA模板l.-Iuu ng/rlL8 ne/FL水足至 25,0sN/T3767.14-2014出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5.2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结 果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管 呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样品转基因玉米59122品系初筛阳性,还 应通过下列方法之一进行确证(见 附录A):按照欧盟C R L V O 3/0 5 V P 进行普通P C R 检测;可对外引物PCR扩增产物进行序列测定,测 序结果见附录A。8 结果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该样 品未检出转基因玉米59122品系”。8.2 检测结果为转基因玉米59122品系初筛 阳性的样品,应 按照确证实验情况进行结果判断和表述。sN/T3767.14-2014附 录 A(资 料性 附 录)转 基 因玉 米59122品系基 因序 列A。l 转基 因玉 米sg122品系外 源 基 因和 玉 米 边 界 序 列(Patent No,Us20060070139)1 CGAACGATTC AGATGGCAAA ACWGAATC TTTTTGTTTG AAGTCCGAAA51 TATAAAv气arTT TcTcGTACTC ACCAACATTG GTGCGCACCT GTGATTGGCT101 CATAAAA/丫rr CTTGGAGGGA CGGAAGAAAG AGTGAAGGGA tAAGCAAG151 AAAGCGCTCA AACACTG姒GTTTAAACTG AAGGCGGG俎ACGACAATCT201 GAT GAGC GGAGAATTAA GGGAGTCACG T刂 GACCCC CGCCGATGAC251 GCGGGACAAG CCGqrAcG TTTGGAACTG ACAGAACCGC AAA.2 引物 碱 基 序 列及 构 成夕 卜 引 物l(F3,5记):CGAACGATTCAGATGGCA夕 卜 引 物2(B3,5-3):TTGCGGTTCTGTCAGTTCF1cF2内 引占勿1(FIP,5-3):CCTTCACTCTTTCTTCCGTCCCTTCTCGTACTCACCAACATTGB1c内 引 0吻2(BIP,5-3):TTAAACTGAAGGCGGGAAACGAGTCATAACGTGACTCCCTTAA环 引 物1(FLP,5-3):TGAGCCAATCACAGGTGC环 引 吻 勿2(BLP,5-3):CAATCTGATCATGAGCGGAGAB2寸一0丨寺一卜z丨767.3HHTs中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第14部分:玉 米59122品系sN/T3767.1-201奎中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总 编 室:(0 1 0)6 8 5 3 3 5 3 3网址w w w.s p C。n e t。c n中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开 本88012301/16 印张0.75 字数lO千字2014年12月第一版 2014年12月第一次 印 刷印数l-1300书 号:1 5 5 0 6 6 2 7 4 6 8 定价1 6.0 0 元4-2014