SNT 3767.10-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第10部分：玉米MON88017品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.102014出口食品中转基因成分环介导第1 0温扩增(LAMP)检测方法部分:玉 米MON88017品系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 10:Maize MON88017 14-013发布 14-Og01实施等国局和啪土森咖民酰人懿华颏中国发布sN/T3767.10-2014亠刖亠一一口SN/T3767出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3 部分:玉 米B t-1 1 品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5 部分:玉米G A 2 1 品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉 米T 2 5 品系;第13部分:玉 米3272品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;、第1 6 部分:大 豆A 5 5 4 7-1 2 7 品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GT泓 032品系;第19部分:大豆MON89788品系;第部分:水 稻Bt-63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小 麦B 7 3-6 品系;第29部分:甜 菜H 1品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第10部分。本部分按照GB/T1.109给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和 国北京 出人境检验检疫局、中华人 民共和 国广东 出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:曾 静、马丹、张蕾、张林、魏海燕、张西萌、李志勇、石磊、常彦磊。sN/T3767.10-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系1 范围SN/T3767的本部分规定增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于玉米及其制本方法的定性检测低限为2 规范性引用文件17品系特异性 的环介导等温扩性的定性检测。下列文件对于本文件的应文件,仅 注 日期的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,于本文件。GB/T6682 分析实验室G B/T 1 9 4 9 5.2 转基 因 产GB/T19495.3 转基 因产 品检测核酸提取GB/T19495.7 转基 因 产 品样 和SN/T3767.22014 出选方法3 防污染措施基 因(LAMP)检测方法 第2部分:筛环介导等温扩增检测过4 抽 样与制样规定。按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5,3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因玉米MON88017品系外源基因和玉米边界序列设计特异性 内引物和外引物各一对,特1sN/T3767.10-2014异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,并 设计一条环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bs莎聚合酶 的作用下启动循环链置换反应,在 特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 入显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green I:一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色由橙色变为绿色钙黄绿素:在 LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子,未 发生反应时锰离子与钙黄绿素结合,钙 黄绿素的荧光被淬灭,呈 现橙色。当扩增反应发生时,扩 增过程 中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结合,形 成不可逆的沉淀物,将 锰离子从钙黄绿素上释放下来,从 而使钙黄绿素恢复荧光,同 时体系中的镁离子与钙黄绿素结合,进一步加强钙黄绿素 的荧光,可 在365nm紫外光激发下散发 出约510nm的荧光,颜 色也 由橙色转为绿色。6,2 仪器和设备6,2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:6 5.0 0,5 和8 5.0 0.5。6.2.3离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:量 程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 d N T P s 溶液:每种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6.3,3 Bs莎DNA聚合酶(如:NEB公司或具有 同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6.3,4 10TlermolPol缓冲液:含0mmol/L Tris H(pH值8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、mmol/L硫酸镁、1%Tton 100。6.3,5 硫酸镁溶液:50mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5m。l/L。6,3,7 显色液:钙黄绿素荧光染料0.312mol/L和SYBR Green I荧光染料,1000。6.3,8 引物:根 据转基因玉米MON88017品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2,和环状下游引物LB。外引物扩增片段长度:6bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):GCTAGCTTGATGGGGATCAG夕 卜 引 窍 勿2(B3,5-3):CTTGTAGATGGCACCGCG内 引 物1(FIP,5-3):GGCAGTATGCCGGAGTTGACC-TCGTTTCCCGCCTTCAGT内引物2(B I P,5 3):CTGGCCGCACGCAGGAAAAATA-CTGTCGTGTCTGACCAAGG下 游 环 引 物(B L P,5 3):G G G C G A A T C A G A A A G G G C G T2sN/T3767,10-20146.4 检测步骤6.4.1 阴性对照、阳性对 照和 空 白对 照 的设置6.4.1,1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6,4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4,1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);IAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4,2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表 明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.214的规定进行。6.4.3 玉米MON88017品系LAMP反应体 系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。表1 玉米MoN88017品系LAMP反应体 系6.4.4 LAMP反应参数6 5.0 o.5 恒温扩增6 0 m i n,8 5.0 0.5 2 m i n 使酶灭活,反应结束。组 分工作液浓度加样量/lI冫反应体 系终浓度T h e r m P l 缓冲液1夕 卜 引物1(F3)1 0 u m l/L0,2 u m l/L夕 卜 引l/w2(B3)10umol/L0,2 u m o l/L内引物1(FIP40um l/L11,6umo1/I内引物2(B I P)40umo1/Ll1,6umol/L下游环引物(BLP)4 0 u m l/L0,8uml/LdNTP10mmd/L1,4 m m o l/L甜菜碱5moI/L51mol/LMgsO45 0 m m o l/L24mm l/L钙黄绿素(Cdcon)a0.312mol/L6,3mmo1/LB s 莎 D N A 聚合酶8U/uLl0,3 2 U/u I 冫DNA模板100ng/uL2B ne/pL水补足至 25,0如果使用SYBR Green I染料,反 应体系中不预先混合荧光染料,多 余体积用水补充至 25uL,在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。sN/T3767.10-20146,4.5 显色反应6,4.5.1 钙黄绿素染料体系:反 应结束后,在 黑色背景下立即进行颜色结果观察。6.4.5.2 SYBR Green I染料体系:反 应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5.2 空白对照:反 应管 中液6.5.3 阴性对照:反 应管中液6.5.4 阳性对照:反 应管中液7 结 果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中各种实验对照结果正常,可 判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反转基因玉米品系MON88017实验对照结果正常,可 判断该样 品确证(见 附录A):按照欧盟的方法(CR氵 Jl刂;可对外引物 PCR扩 增产物进行序列测定8 结 果表述8.1 8 2表述。检测结果为阴性,表 述检测结果为转基因玉米性 的品系”。照确证实验情况进行结果判断和sN/T3767.10-2014附 录 A(资 料性附录)转基因玉米MoN88017品系基因序列A.1 转基因玉米MoN88017品系外源基因和玉米边界序列GACCTGCAGA AGCTAGCTTG ATGGGGATCA GATTGTCGTT TCCCGCCTTCAGTTTAAACA GAGT ACTGCCGAAACGCACGCAGGACAAACCAAT CCGTCACCAAAAATAAGT TGCGACCCGTCCGGCCTTGGTCAGACA CGACAGCCAAGGGTCCAGTGCCATCTAA。2 引物 碱 基 序 列 及 构 成F3:GCTAGCTTGATGGGGATCAB3:CTTGTAGATGGCACCGCGF1cAGTATGCCGGAGTTGABlcBIP:CTGGCCGCACGCAGGAAAAATBLP:GGGCGAATCAGAAA717172217271732173717421FIP:寸冖0丨冖卜Pz中华人民共和国出人境检验检疫行业标准出口食 品中转基 因成分环介导等温扩