SNT 3767.3-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第3部分：玉米Bt-11品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767。-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第3部分:玉 米Bt-11品系Loop Jmediated isothermaI amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part3:江 aize Bt-11201午0卜 13发布2014-08-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布sN/T3767.3-2014亠一一囗亠刖SN/T3767出口食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt-11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5 部分:玉米G A 2 1 品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉米M O N 8 8 o 1 7 晶系;第1 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米T-25品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大 豆A 2 7 0 4-1 2 品系;、第16部分:大 豆 A5547127品系;第17部分:大 豆 DP356043品系;第18部分:大 豆 GT泓32品系;第19部分:大 豆 MON89788品系;第20部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第”部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小麦B 7 3-6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第3部分。本部分按照 GB/T1,109给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。本部分起草单位:中 华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人 民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:徐 君怡、郑秋月、徐杨、刘金华、曹际娟、李志勇、徐静、赵昕、石磊、凌莉、常彦磊、刘津、唐大运。sN/T3767.3-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第3部分:玉 米Bt-11品系1 范围SN/T3767的本部分规定了检测方法。本部分适用于玉米及其加工本方法的定性检测低限为0,2 规范性引用文件的环介导等温扩增(LAMP)初筛定性检测。下列文件对于本文件的应用件,仅 注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,本文件。GB/T6682 分析实验室用G B/T 1 9 4 9 5.2 转基 因 产 品G B/T 1 9 4 9 5.3 转基 因 产 品 检 测核酸提取纯G B/T 1 9 4 9 5.5 转基 因 产 品 检定 量GB/T19495.7 转基 因 产 品和SN/T3767,22014 出口因MP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽 样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6,1 原理6,1.1 一般原理根据转基因玉米Bt-11品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对,sN/T3767,3-2014特异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引向特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应,在 玉米Bt11品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6,1.2 显色液显色原理SYBR GreelI是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2,1 超纯水发生器。6,2.2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0.5 和8 0.0 0.5。6,2.3 离心管:0,1 m L、1.5 m L。6.2.4 移液器:量程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。i6.3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3,2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6.3,3 Bs莎DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果 的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6,3.4 10ThermolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、mm。l/L硫酸镁、1%Tton 100。6.3.5 硫酸镁溶液:150mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5m。l/L。6.3.7 显色液:SYBR Green I荧 光染料,1000。6.3,8 引物:根 据转基因玉米Bt11品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1,内引物2,环引物1和环引物2。外引物扩增片段长度:192bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):GCTGTAGCTGGCCTAATC夕 卜 引 牛 勿2(B3,53):GGCCAAGGTATCTAATCAGC内 弓H吻1(FIP,5-3):TATCTGTCTCAGGGGCAGACTCTCAACTGGTCTCCTCTCC内 引 物2(BIP,5-3):GCCAAGAAGGCGCAAGTCCATCCCATTTGTGATCTTTGTC环 引 牛 勿1(FLP,5-3):GTGTTCCCTCGGATCTCG环 引 物2(BLP,53):ACCGCGAGTTGTTGTATCATA6.4 实验步骤6,4,1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6,4,1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2sN/T3767.3-20146,4,1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4,1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA,可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.214的规定进行。6.4,3 玉米Bt-11品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uI显色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进入反应液中。表 1 玉米Bt-11品系 LAMP反应体系6,4.4 LAMP反应参数6 3.0 o.5 恒温扩增9 0 m i n,8 0,0 0,5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6.4,5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5,1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。组 分工作液浓度加样量/uL反应体系终浓度T h e r m P o 1 缓冲液1夕 卜 狈 刂 L游引物(F3)10umol/L0.2 u m o l/L外侧下游引物(B3)10um1/L0.50,2 u m l/L内侧上游引物(FIP)4 0 u m o l/L1.6umol/L内侧下游引物(BIP)4 0 u m l/L1.6uml/L上游环引物(FLP)20umoI/L0.8um1/L下游环引物(BLP)20umoI/L1.00.8umo1/LdNTPs1 0 m m o l/L1,6 m m o l/L甜菜碱5moI/L51mol/L硫酸镁150mmol/Ll6mm l/LB 踮D N A 聚合 酶8U/uLl0,32U/uLDNA模板I00 ns/pL2B ng/pL水补足至 25,0sN/T3767.3-20146,5,2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6,5.3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。6,5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结 果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管 中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管 中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因玉米Bt-11品系初筛阳性0附录A):按照GB/T19495,5进可对外引物PCR扩增8 结 果表述8,1 检测结果为阴性,表 述为“该样8.2 检测结果为转基因玉米Bt-进行结果判断和表述。sN/T3767.3-2014附 录 A(资 料性附录)转基因玉米Bt-11品系基因序列A.1 转基 因 玉 米B 1 1 品系 特 异 目 标 序 列(来自A c c e s s i o n n o。A Y 1 2 3 6 2 4.1 和A Y 6 2 9 2 3 6)GCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGAA,2 引物碱基序 列及构成F3:GCTGTAGCTGGCCTAB3:GGCCAAGGTATCTAATCAGCF1cFIP:TATcTGTCTCAGGGGCACTGGTCTCCTCTCCB1cGCCAAGAAGGCGCATTTGTCGTGTTCCCTCGGATACCGCGAGTTGTTGI:LL F B寸一O甲而.卜卜卜z丌Ns中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第3部分:玉 米Bt-11品系sN/T3767,-2014中 国 标 准 出 版 社 出 版北京 市 朝 阳 区和平 里 西街 甲2号(100029)北京 市 西城 区三 里河 北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址w w w.s p C。n e t。c n中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开 本8 8 0 1 2 3 0 1/1 6 印张0,7 5 字数1 2 千字14年11月第一版 201碴年11月第一次印刷印数11300书 号:1 5 5 0 6 6 2 7 4 3 0 定价1 6,0 0 元3767,3-2014