SNT 3767.20-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第20部分：水稻Bt-63品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767,202014出口食品中转基因成分环介导温扩增(LAMP)检测方法部分:水 稻Bt63品 系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 20:Rice Bt-63 14-O13发布 14-08-01实施等第中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T3767.20-2014亠刖亠一一曰SN/T3767出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt11品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5 部分:玉 米G A 2 1 品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第12部分:玉 米T25品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T 泓 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第2 4 部分:水 稻L L R I C E 6 2 品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第2 7 部分:水 稻T 2 A 1 品系;第2 8 部分:小麦B 7 3 6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第部分。本部分按照GB/T1.109给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和 国广东 出人境检验检疫局、中华人 民共和 国汕头 出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人 民共和国福建出人境检验检疫局、中华人 民共和国辽宁出人境检IsN/T3767.20-2014验检疫局、中华人 民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人 民共和国北京 出人境检验检疫局、中华人 民共和国上海出人境检验检疫局、仲恺农业工程学院、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:易 敏英、凌莉、卓锦雪、蔡颖、刘静宇、谢力、陈颖、邵碧英、曹际娟、冯家望、曾静、李晓虹、高苏娟、石磊、张隽、陈源树、李婷 t关 丽军、李志勇。出口食品中转基因成分环介导等温扩增(AMP)检测方法第 部分:水 稻 Bt-63品系1 范围S N/T 3 7 6 7 的本 部分 规 定 了稻 谷 和大米 中转基 因水 稻B t 6 3(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于稻谷和大米 中本方法的定性检测低限为0。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是日期的引用文件,仅 注 日期的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,本文件。GB/T6682 分析实验室用GB/T19495.2 转基 因 产 品GB/T19495.3 转基 因 产 品G B/T 1 9 4 9 5.7 转基 因 产 品 检 测样和制sN/T2584 水稻及其产品中分法SN/T3767.22o14 出口因LAMP)检测方法第 2部 分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程4 抽样与制样按照 GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根 据转基 因水 稻Bt-63品系外 源基 因和水 稻边早序列设 计 特异性 内引物和外 引物各一对,特 异性-1sN/T3767.20-2o14品系特异性 的环介导等温扩增检测。sN/T3767.20-2014目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应,在 水稻Bt63品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰莱结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的 小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分 子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2,2 水浴锅或加热模板:6 3。0 0.5 和8 0。0 0,5。6.2.3离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液 器:量程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。、6.3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6.3.3 B耐DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6.3.4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液:含0 m m o l/L T s H C l(p H 值为8.8)、1 0 0 m m o l/L 硫酸铵、100mmol/L氯化钾、mmol/L硫酸镁、1%T。ton 100。6.3.5 硫 酸镁溶液:150mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5m。l/L。6,3.7 显 色液:SYBR Green I荧光染料,1000。6.3.8 引物:根 据转基因水稻Bt63品系外源基 因和水稻边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:9bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):TCTTGCCCGGCGTCAAT夕 卜 引 牛 勿2(B3,5-3):TTCGTAGCCCCACCACTAC内 引 物1(FIP,5-3):TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT内 引 4勿2(BIP,5-3):GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC6.4 检测步骤6,4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4.1.2 阳性对照:采用含有 目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板,浓 度应略高于方法检测低限。2丨|IsN/T3767.20-20146,4.1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);TLAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767,214的规定进行。6.4.3 水稻B 63品 系LAMP反应体 系LAMP反应体系见表1。每个样 品各做2个平行管。加样时应使样 品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液 中。表1 水稻B 63品 系LAMP反应体系6.LAMP反应参数6 3.0 o.5 恒温扩增9 0 m h,8 0.0 o.5 5 m i n 使酶灭活,反 应结束。6.4.5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5.2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反 应管 中液体呈橙色。组 分工作液浓度力 口 样量/fiL反应体系终浓度ThermolPol缓冲液1夕 卜 狈 刂 L游弓 H勿(F3)10umol/L0.2uml/L夕 卜 狈 刂 下游弓 H勿(B3)10umol/L0,2 u m o l/L内侧上游引物(FIP)40 pmol/L1,01,6umol/L内侧下游引物(BIP)40uml/L1.o1,6um1/LdNTPs10mmol/L1.6mmol/L甜菜碱5md/Lo,8mol/L硫酸镁150mmol/L16mm l/LBs莎DNA聚合酶8U/uL1o,32U/uLDNA模板100 nglpl-8 ne/pL水补足至 25,0sN/T3767.20-20146.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因水稻Bt-63品系初筛阳性 还应通过下列方法之一进行确证(见附录A):按照S N/T 2 5 8 4 进行实时荧光P C R 检测;可对外引物PCR扩增产8 结果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该样品未检出转8.2 检测结果为转基因水稻Bt-63品系初实验情况进行结果判断和表述。sN/T3767.202014附 录 A(资 料性 附录)转基 因水稻Bt-63品系基 因序 列A,1 转基因水稻B t-6 3 品系特异目标序列(来自A c c e s s i o n n o。H Q 1 6 1 0 5 5.1)1669TCTTGCCCGGcG1681TCAACGGG ADATACCGcGCCACATAGC AGAAcTTTAA CccCcGAAcA TcGccTCGCT1741CC冫GTC y GACTGG TGATG GC1801GGCCj、TGCCTGG0GTCGAG躬 屺 GGGT1861AGTGGTGGGG cTAcGAAA,2 引物 碱 基 序 列及 构 成F3:TCTTGCCCGGCGTcAATB3:TTCGTAGCCccACCAcTACTTGACTGGAGCGAGGCGB1cBIP:GACCGcTGTTATGcGGCC寸冖0丨卜z中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第部分:水 稻B 63品 系SN/T3767,20-2014中 国 标 准 出 版 社 出 版北京 市 朝 阳 区和平 里 西街 甲2号(100029)北 京 市西 城 区三里 河 北街16号(100045)总编 室:(010)68533533网址w w w.s p C。n e t。c n中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开 本8 8 0 1 2 3 0 1/1 6 印张0.7 5 字数1 0 千字14年12月第一版 14年12月第一次印