SNT 3731.4-2017 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法.pdf

SN/T3731.4-20177.5微量移液器(2.5 L,20L,200 L,1000 L)。7.6研钵及粉碎装置。7.7涡旋振荡器。7.8pH计。7.9天平：感量0.01g。8检验步骤8.1DNA提取将样品研磨后，称取200mg左右固体样品或200L液体样品于2mL离心管中，加入1.5mLCTAB提取缓冲液和10L蛋白酶K溶液。60C振荡过夜后13000g离心10min,转移上清液到新的离心管中。加入750L氯仿后用力振荡，13000g离心5min,将上清液转移到新的离心管中。加人2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60 min,13000g离心15min,弃去上清液。加人350LNaCl溶液将沉淀进行悬浮。再加入350L氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min。转移上清液后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min,13000g离心10min,弃去上清液。加人500L70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200LTE溶液中。立即使用或-20保存备用。也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。8.2DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式(1)计算，当A260/A比值在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增：c=AN 50/1000(1)式中：cDNA浓度，单位为微克每微升（g/L);A260nm处的吸光值N核酸稀释倍数。8.3实时荧光PCR扩增8.3.1反应体系的体积为25L:实时荧光PCR混合液12.5L、正反向引物(10mol/L)各1L、探针(10 mol/L)1 L、模板 DNA 5 L,水补足至25 L。8.3.2实荧光PCR应条件随仪器不同略有，一般为：502 min;95 10 min;9515s,60 1 min,40个循环。8.3.3每个样品设置两个平行的反应体系。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含火鸡成分的样品作阳性对照，用已知不含火鸡成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值=40.0；b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值=40.0；c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0。3